基于聚乙烯亚胺纳米粒子的

基于聚乙烯亚胺纳米粒子的
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f mri造影剂及其制备
技术领域
1.本发明属于磁共振成像技术领域，具体涉及基于聚乙烯亚胺纳米粒子的
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f mri造影剂及其制备。


背景技术：

2.聚乙烯亚胺(pei)是一种被广泛使用的高分子聚合物，可分为线状的pei分子和支链状的pei分子。其中，支链状的pei分子结构中含有大量的伯胺、仲胺以及叔胺三种氨基，并且具有三维网状结构，正电荷密度较高，具有较高的反应活性。因此，可以对pei进行不同的表面修饰以实现其各种功能化。目前，pei常被用于气体吸附、金属离子检测、药物载体、抗菌材料、影像诊断等方面。
3.磁共振成像技术(mri)是一种利用磁共振现象获取电信号的新兴成像方式，相比于其他成像技术，具有更强的穿透能力、无辐射伤害，可以得到任何方向的断层图像、三维体图像，甚至可以得到空间-波谱分布的四维图像，能够用于生物体中组织器官的成像，因此被广泛应用于临床诊断中，并且由于其具有多重优势，同时成为了国内外医疗影像领域的研究热点。
4.mri的工作原理为：通过对静磁场中的人体施加某种特定频率的射频脉冲，使人体中的氢质子受到激励而发生磁共振现象。其成像原理为：常见的原子核(如1h、
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b、
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c、
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o、
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f、
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p)存在自旋运动，通常情况下，原子核自旋轴的排列是无规律的，但将其置于外加磁场中时，核自旋的取向会由无序向有序过渡，自旋的核同时也会以自旋轴和外加磁场的向量方向的夹角绕外加磁场向量旋进，即拉莫尔旋进。自旋系统的磁化矢量由零逐渐增长，当系统达到平衡时，磁化强度达到稳定值。而此时核自旋系统受到一定频率的射频激发，原子核即可引起共振效应。因此，自旋核还要在射频方向上旋进，这种叠加的旋进状态称为章动。在射频脉冲停止后，自旋系统已激化的原子核，则不能再维持这种状态，将回复到磁场中原来的排列状态，同时释放出微弱的能量，成为射电信号，将该电信号收集，即可得到运动中原子核的分布图像。其中，处于高能激发态的原子核回到能量较低的稳定状态的过程称为弛豫过程，其所需的时间即弛豫时间，t1为纵向驰豫时间，通常用于一直磁共振的信号强度/成像强度，提高可视化饱和度，t2为横向弛豫时间，通常用于辨别病变组织，因为组织病变后具有较长的t2。
5.目前，临床上大多应用的是1h mri，但由于组织中大量存在的1h会产生背景干扰，且正常组织与背景组织的环境差异较小，导致1h mri通常需要借助造影剂来增加对比度，从而提高成像效果。此外，目前常用的1h mri造影剂对人体存在损伤，容易造成脑沉积、肾源性系统纤维化等疾病。而
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f mri是一种具有潜力的mri，相比于1h mri，
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f mri具有自然丰度高、化学位移对组织局部环境更加敏感且几乎不存在内源性的背景干扰等优势，能够得到更为清晰的mri图像以便于某些疾病的早期诊断，因此
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f mri具有巨大的发展空间。
6.综上所述，有必要基于聚乙烯亚胺(pei)开发一种生物相容性好的
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f mri造影剂。


技术实现要素：

7.为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子的制备方法。
8.本发明的第二个目的是提供采用上述制备方法制备得到的peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子。
9.本发明的第三个目的是提供上述peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子的应用。该纳米粒子具有
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f mri成像效果，生物相容性良好，可作为
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f mri造影剂。
10.本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
11.本发明提供一种peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子的制备方法，该方法包括以下步骤：
12.s1、聚乙烯亚胺纳米粒子的制备：先将聚乙烯亚胺水溶液和双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠加入有机溶剂中，然后对所得混合溶液进行超声混合，混合后加入戊二醛水溶液，静置后再加入乙醇离心收集沉淀，即可制备得到聚乙烯亚胺纳米粒子；
13.s2、氟化聚乙烯亚胺纳米粒子的制备：将步骤s1的聚乙烯亚胺纳米粒子和1，1，1-三氟-3-碘丙烷加入有机溶剂中，经加热反应后收集沉淀即得氟化聚乙烯亚胺纳米粒子；
14.s3、peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子的制备：将步骤s2的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺加入有机溶剂中，经室温反应后收集沉淀即得peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子。
15.优选地，所述聚乙烯亚胺水溶液的质量分数为20-40％，所述戊二醛水溶液的质量分数为40-60％；所述聚乙烯亚胺水溶液、双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠、有机溶剂和戊二醛水溶液的用量比为3ml：(0.8-1.1)g：(30-33)ml：(150-200)μl。
16.进一步地，所述聚乙烯亚胺水溶液的质量分数为30％，所述戊二醛水溶液的质量分数为50％。
17.优选地，所述聚乙烯亚胺纳米粒子、1，1，1-三氟-3-碘丙烷和有机溶剂的用量比为100mg：(2.5-3)ml：(20-30)ml。
18.优选地，所述氟化聚乙烯亚胺纳米粒子、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺和有机溶剂的用量比为100mg：(250-300)mg：(150-200)mg：(20-30)ml。
19.优选地，步骤s1所述超声混合的时间为8-10min，且在戊二醛水溶液加入过程中保持超声，加入后结束超声，静置的时间为2-5min。
20.优选地，步骤s2的加热反应为55-65℃下加热反应18-24h。
21.进一步地，步骤s2的加热反应为60℃下加热反应24h。
22.优选地，步骤s3的室温反应的时间为18-24h。
23.本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
24.本发明还提供了采用所述的制备方法制备得到的peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子。
25.本发明先将支链pei高分子制备成纳米粒子，并对pei纳米粒子进行氟化修饰，使其连接含氟官能团而具有
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f mri成像效果，并且再修饰peg提高其生物相容性，使其成为良好的
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f mri造影剂。
26.本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：
27.本发明还提供了所述的peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子在制备磁共振造影剂中的应用。
28.本发明还提供了一种
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f mri造影剂，所述造影剂包括所述的peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子。
29.本发明提供的peg修饰的氟化聚乙烯亚胺纳米粒子具有
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f mri成像效果，生物相容性良好，可作为
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f mri造影剂。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
31.本发明公开了一种基于聚乙烯亚胺纳米粒子的19f mri造影剂的制备方法，利用超声处理使支链状pei分子分散在细乳液环境中，并利用戊二醛使其发生分子间交联，得到粒径大小为100-200nm之间的pei纳米粒子。同时，该方法所制得的pei分子含有大量的叔胺基团，能够与卤代烃发生menschutkin反应，且该反应活性较高，从而能够引入大量的含氟基团，使其具有
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f mri造影功能。在此基础上通过表面修饰peg以增强其亲水性并屏蔽其表面过高的正电性，从而使其成为生物相容性良好的
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f mri造影剂。
附图说明
32.图1为pei-cf3-peg纳米粒子的制备流程图；
33.图2为pei纳米粒子(a)、pei-cf3-peg纳米粒子(b)的透射电镜图；
34.图3为pei纳米粒子的粒径分布图；
35.图4为pei纳米粒子、pei-cf3纳米粒子、pei-cf3-peg纳米粒子的zeta电位；
36.图5为pei-cf3-peg纳米粒子的粒径分布图；
37.图6为pei-cf3-peg纳米粒子的细胞毒性(a,b用于区分hela细胞和huvec细胞)；
38.图7为pei-cf3-peg纳米粒子的f nmr图谱。
具体实施方式
39.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
40.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
41.实施例1 peg修饰的氟化聚乙烯亚胺(pei)纳米粒子的制备
42.peg修饰的氟化聚乙烯亚胺(pei)纳米粒子，简称pei-cf3-peg纳米粒子，根据图1的制备流程，其制备包括以下步骤：
43.(1)pei纳米粒子的制备
44.将3ml质量分数为30％的pei(mw＝10000)水溶液和1g双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(aot)加入到30ml甲苯(toluene)中，用超声破碎仪对上述混合溶液超声(ultrasonic)混合10min，然后向体系中滴加180μl质量分数为50％的戊二醛(glutaraldehyde)水溶液，滴加的过程保持超声，滴加结束后停止超声。静置3min后再往上述溶液中加入30ml无水乙醇，13000rpm离心10min后收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤三次后得到pei纳米粒子。
45.采用200kv透射电子显微镜对该步骤得到的pei纳米粒子进行扫描，所得的tem图像如图2(a)所示。
46.同时，将该步骤得到的pei纳米粒子重悬于纯水中，稀释成50μg/ml的分散液，然后利用malvern zetasizer nano s动态光散射仪测量其粒径分布及zeta电位，所得的分布图像及zeta电位分别如图3和图4所示。
47.图2(a)和图3显示，该方法制备的pei纳米粒子的平均粒径为90nm左右，平均水合粒径为131.2nm，且分散性较好，粒径均一。图4显示pei纳米粒子的zeta电位为 22.2mv，原因在于其表面具有大量的氨基。
48.(2)pei纳米粒子的氟化(fluorined)
49.将100mg pei纳米粒子加入到30ml无水乙醇中，再加入2.6ml 1,1,1-三氟-3-碘丙烷，500rpm搅拌下60℃加热反应24h，反应结束后，13000rpm离心(centrifugation)10min，收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤三次，得到氟化pei纳米粒子(pei-cf3纳米粒子)。
50.将该步骤得到的氟化pei纳米粒子重悬在纯水中，并稀释成50μg/ml的分散液，然后利用malvern zetasizernano s动态光散射仪测量其zeta电位，所得的zeta电位如图4所示，为 77.8mv，原因在于卤代烃进攻叔胺后使叔胺转化为季铵，因此带有大量正电荷。
51.(3)氟化pei纳米粒子的peg修饰(peg modified)
52.将100mg氟化pei纳米粒子加入到30mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入250mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，150mg n-羟基琥珀酰亚胺，500rpm搅拌下室温反应24h，反应结束后，13000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀依次用纯水和无水乙醇各洗涤三次，得到peg修饰的氟化pei纳米粒子(pei-cf3-peg纳米粒子)。
53.采用200kv透射电子显微镜对该步骤得到的peg修饰的氟化pei纳米粒子进行扫描，所得的tem图像如图2(b)所示。
54.同时，将该步骤得到的peg修饰的氟化pei纳米粒子重悬在纯水中，并稀释成50μg/ml的分散液，然后利用malvern zetasizernano s动态光散射仪测量其粒径分布及zeta电位，所得的分布图像及zeta电位分别如图4和图5所示。
55.图2(b)和图5显示，该方法制备的peg修饰的氟化pei纳米粒子的平均粒径为150nm左右，平均水合粒径为200.3nm，且分散性较好，粒径均一。图4显示peg修饰的氟化pei纳米粒子的zeta电位为 9.4mv，原因在于peg分子链屏蔽了大量的正电荷。
56.实验例1利用mtt法对peg修饰的氟化pei纳米粒子进行细胞毒性检测
57.具体实施方法为：用含有10％fbs、1％双抗(100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的dmem高糖培养基培养hela/huvec细胞。然后以约10000cfu/ml的细胞密度将hela/huvec细胞接种到96孔细胞培养板中，为确保细胞贴壁，将培养板置于37℃下培养15h。随后加入不同量(5、1、0.8、0.5、0.25、0.1mg/ml)的pei-cf3-peg纳米粒子(实施例1)，于37℃且二氧化碳浓度为5％的条件下分别培养24小时和48小时。之后向每孔中加入20μl四甲基噻唑基四唑(mtt)溶液(5mg/ml)，并将孔板置于37℃的培养箱中继续培养，大约4小时后，将培养液吸出，每孔加入120μl二甲基亚砜(dmso)。最后用酶标仪测量各培养液在492nm处的吸光度数值。实验结果如图6所示。
58.图6的结果显示，本发明方法制备的peg修饰的氟化pei纳米粒子在5mg/ml浓度时对hela/huvec细胞均没有明显的细胞毒性，在所设置的浓度梯度下该细胞的存活率均高于
80％。
59.实验例2对peg修饰的氟化pei纳米粒子进行
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f nmr检测
60.具体实施方法为，将10mg实施例1制备的pei-cf3-peg纳米粒子分散在0.8ml纯水中，然后利用bruker核磁共振仪对纳米粒子分散液进行
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f nmr检测，检测结果如图7所示。
61.图7的结果显示，本发明方法制得的peg修饰的氟化pei纳米粒子在-64.3ppm的化学位移处有明显的特征峰，说明其具有
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f mri造影功能，可作为
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f mri造影剂。
62.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。