本发明属于基因工程及分子生物学领域,具体涉及一种咖啡树谷氨酸脱羧酶基因克隆和原核表达方法以及gaba制备方法。
背景技术:
1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,gaba)是一种天然存在于动物、植物、微生物中的非蛋白质氨基酸,具有缓解焦虑、改善失眠、调节血压、抗糖尿病及延缓衰老等多种生理功能,在医药、食品和化工领域有广泛的应用前景。gaba作为一种植物的次生代谢产物,在逆境胁迫下(包括厌氧、盐胁迫、低温胁迫等)可在植物体内迅速积累,其中谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,gad)是gaba合成过程中的关键限速酶,在gaba的合成过程中起重要作用。虽然,可以通过非生物胁迫富集植物中的gaba,但是该方法存在产率低以及产物分离困难等缺点。因此,通常通过化学或生物合成法进行gaba大量制备。化学合成法需要用到多种对人体有害的化学试剂,并且设备成本高。生物合成法通常以谷氨酸钠为底物,利用微生物体内的gad催化生产gaba。该方法具有条件温和、成本低、安全性高、产率高等优点。
2、目前,生物合成法主要通过产gaba的天然菌株、诱变菌株以及含有gad基因的重组工程菌发酵生产gaba。所构建的gad基因工程菌主要利用微生物来源的gad基因进行构建,但是利用植物来源的gad基因来构建重组菌生产gaba的研究鲜有报道。而且关于含有咖啡树gad基因的基因工程菌的构建,以及用该菌表达、纯化的gad酶生产gaba的方法也未见报道。
技术实现思路
1、为解决现有用于生产植物来源的gad以及其产物gaba的生物合成法少的现状,本发明提供一种咖啡(coffea arabica)树(源自云南省德宏州芒市咖啡种植园)谷氨酸脱羧酶基因克隆方法、原核表达方法及gaba制备方法,为利用植物来源gad生物合成gaba提供一种安全有效的新方法。
2、为了实现本发明的目的,本发明采取如下技术方案:
3、本发明基于咖啡(coffea arabica)树的基因组获得一种咖啡树谷氨酸脱羧酶(记为cag ad),氨基酸序列如seq id no.2所示,497个氨基酸;cagad其对应的编码基因记为cagad,其核苷酸序列如seq id no.1所示,1494bp基因片段。
4、(一)、一种cagad的克隆方法,包括如下步骤:
5、(1)提取咖啡树嫩叶中的总rna,对提取的总rna进行反转录,得到cdna;
6、(2)通过巢式pcr获得咖啡树谷氨酸脱羧酶基因:首先以步骤1得到的cdna作为模板,cagad1为引物,利用pcr扩增得到第一轮扩增产物;进一步以第一轮扩增产物为模板,cagad2为引物,利用pcr扩增得到第二轮产物,将目的条带进行回收,即为咖啡树gad开放编码区的基因片段,记为cagad;
7、cagad1-f:5’-gaaaccatcatatttgcctttttcc-3’;
8、cagad1-r:5’-ctctaccacgctcaagtcca-3’。
9、cagad2-f:5’-atggttatctccaagactgca-3’;
10、cagad2-r:5’-tcagcaaacgccattgg-3’。
11、(二)、一种构建cagad重组大肠杆菌的方法,包括如下步骤:
12、(3)首先对步骤(2)得到的cagad进行平末端加a处理:配制反应体系,混匀后进行反应,反应后完成平末端加a处理,得到cagad加a产物;
13、然后再将cagad加a产物与t克隆载体用t4 dna连接酶连接,得到t克隆载体连接体系;
14、所述反应体系由15μl cagad、4μl tailing-a reaction buffer(5×)和1μl taqdna polymerase组成。
15、所述反应的条件为:72℃反应30min;所述用t4 dna连接酶连接操作为:于16℃过夜,完成连接。
16、所述t克隆载体为pgm-t。
17、(4)将得到的t克隆载体连接体系转化至大肠杆菌克隆感受态细菌e.coli top10中,获得重组t克隆载体细菌;
18、(5)将步骤(4)中获得的重组t克隆载体细菌的菌液经加热处理后离心取上清液;并以上清液作为cdna模板,用带有酶切位点bamhi和hindiii的特异性引物mcagad进行pcr反应,反应后将目的条带进行回收,获得带有酶切位点的目的基因;
19、所述加热处理的温度为100℃,时间为10min;
20、所述mcagad引物序列如下:
21、mcagad-f:5’-ctcggtaccctcgagggatccatggttatctccaagactgcatcc-3’;
22、mcagad-r:5’-agactgcaggtcgacaagctttcagcaaacgccattggtcc-3’。
23、(6)将原核表达载体pcold-tf进行双酶切反应后将目的条带进行回收,获得线性化载体;并通过同源重组将步骤(5)获得的带有酶切位点的目的基因与线性化载体连接,构建得到pcold-tf-cagad重组质粒;
24、(7)将步骤(6)得到的pcold-tf-cagad重组质粒通过热激法转化至大肠杆菌克隆感受态细菌e.coli top10中,得到pcold-tf-cagad-top10重组菌株;然后再提取重组菌株pcold-tf-cagad-top10中的质粒并将其转化至大肠杆菌表达感受态细菌e.coli bl21(de3)中,得到pcold-tf-cagad-bl21重组菌株。
25、(三)、一种诱导cagad重组蛋白原核表达的方法,包括如下步骤:
26、(8)将pcold-tf-cagad-bl21重组菌株的单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素钠(amp)的lb液体培养基中,于37℃、180rpm培养过夜后,得到培养液;再以1:40的接种量接种于含100μg/ml amp抗性的lb液体培养基中,于37℃、180rpm培养至od 600值在0.5-0.8之间,然后再加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.8mmol/l,最后在20℃、130rpm下诱导表达16h,经离心、收集菌体沉淀。
27、(四)、一种cagad重组蛋白纯化的方法,包括如下步骤:
28、(9)收集步骤(8)中得到的菌体沉淀,加入裂解液对重组大肠杆菌进行裂解,裂解后离心取上清液,即为粗酶液;将上清液通过镍柱层析法纯化,并通过50kda超滤管超滤浓缩除杂,得到cagad重组纯化蛋白;
29、优选的,所述裂解液与菌体沉淀的用量关系为1g菌体沉淀中加入20ml裂解液。
30、(五)、一种gaba的生产方法,包括如下步骤:
31、(10)向步骤(9)中得到的cagad重组纯化蛋白中加入预热至一定温度的0.1mol/lna2hpo4-0.05mol/l柠檬酸缓冲液,所得混合液进行第一次反应,反应后再升温至一定温度进行第二次反应,反应后即得到gaba。
32、其中,cagad重组纯化蛋白与0.1mol/l na2hpo4-0.05mol/l柠檬酸缓冲液的体积比为1:5,所述预热至一定温度为40℃;其中纯化蛋白的蛋白浓度为50-100μg/ml;0.1mol/lna2hpo4-0.05mol/l柠檬酸缓冲液的ph为5.0,并且包含1mmol/l磷酸吡哆醛和0.1mol/l谷氨酸钠。
33、所述第一次反应的温度为40℃,时间为10min;所述第二次反应的温度为100℃,时间为10min。
34、本发明的有益效果:
35、本发明所述的cagad重组蛋白的体外表达方法,保证了cagad重组蛋白的可溶性与活性,且该方法具有成本低、产量高的优点;本发明纯化得到的cagad重组蛋白能够高效催化谷氨酸钠生成gaba,该生产方法具有安全、条件温和、转化率高等特点,具有良好的应用前景。
1.一种cagad,其特征在于,所述cagad的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种cagad的克隆方法,其特征在于,制备步骤如下:
3.一种cagad,其特征在于,所述cagad是对权利要求1或2中所述cagad进行编码所得;氨基酸序列如seq id no.2所示,具有497个氨基酸。
4.一种cagad重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
5.根据权利要求4所述的一种cagad重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,步骤(1)中所述反应体系由15μl cagad、4μl tailing-a reaction buffer(5×)和1μl taq dnapolymerase组成。
6.根据权利要求4所述的一种cagad重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,步骤(1)中所述反应条件为:72℃反应30min;所述用t4 dna连接酶连接操作为:于16℃过夜,完成连接;所述t克隆载体为pgm-t。
7.根据权利要求4所述的一种cagad重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,步骤(3)中接种量为1%,培养的条件为:180rpm、37℃培养45min;加热处理的温度为100℃,时间为10min。
8.一种cagad的原核表达及纯化方法,其特征在于,包括以下步骤:
9.一种gaba生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
10.根据权利要求9所述的一种gaba生产方法,其特征在于,cagad重组纯化蛋白与0.1mol/l na2hpo4-0.05mol/l柠檬酸缓冲液的体积比为1:5,所述预热至一定温度为40℃;其中纯化蛋白的蛋白浓度为50-100μg/ml;0.1mol/l na2hpo4-0.05mol/l柠檬酸缓冲液的ph为5.0,并且包含1mmol/l磷酸吡哆醛和0.1mol/l谷氨酸钠;