本发明属于生物，涉及nk细胞外泌体联合nk细胞在三阴性乳腺癌治疗中的应用。
背景技术：
1、乳腺癌是一种异常乳腺细胞生长失控并形成肿瘤的疾病，如果不加以控制，肿瘤会扩散到全身并致命其中三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的20％，侵袭性强、易转移、预后极差，可谓乳腺癌中最“毒”的一种亚型，目前治疗上存在诸多难点。三阴性乳腺是指癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和人表皮生长因子受体-2(her-2)均为阴性的乳腺。由于三阴性乳腺癌缺少er、pr和her-2的表达，因此针对三阴性乳腺癌的靶向药物较少，内分泌治疗和针对her-2的靶向治疗对三阴性乳腺癌均无作用。虽然三阴性乳腺癌对化疗比较敏感，但通常只有约20％的患者有很好的化疗效果，因此需要更有效的治疗手段。
2、目前乳腺癌的治疗已经进入了分子分型时代，部分亚型已经找到了有效的治疗靶点。比如，her-2阳性乳腺癌的抗her-2靶向治疗，内分泌激素受体阳性乳腺癌的抗激素内分泌治疗，但三阴性乳腺癌缺乏明确的治疗靶点，化疗是主要的治疗手段。近年来，利nk细胞、细胞毒性cd8+t淋巴细胞或巨噬细胞的新一代免疫疗法被开发出来，以实现肿瘤特异性靶向并规避不良反应。然而，基于细胞的免疫治疗的进展受到肿瘤微环境和肿瘤源性细胞外囊的联合作用的阻碍，这使得癌细胞的免疫原性降低。外泌体(exosome)是由细胞内多泡体(multivesicularbody，mvb)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。它是一种直径为30-100 nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mrna和mirna等物质。目前外泌体已经被证明与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有。nk细胞来源外泌体(nk-exos)是nk细胞通过胞吐的方式，释放到细胞外的囊泡，nk-exos具有跟nk细胞相似的细胞杀伤性，含有多种细胞毒性蛋白(穿孔素、颗粒酶、颗粒溶素等)，mirna和细胞因子等，能够诱导肿瘤细胞凋亡，在肿瘤的治疗中发挥重要的作用。然而，令人遗憾的是目前nk-exos在乳腺癌的研究数量较少，在乳腺癌中的应用效果以及其作用机制仍不明确，还需进一步实验进行探究。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中三阴性乳腺癌治所使用的化疗效果差、靶向治疗缺乏明确治疗靶点、细胞的免疫治疗免疫原性差及安全性低的问题，实现肿瘤特异性靶向并规避不良反应，为三阴性乳腺癌的临床治疗提供新的方向和方案。
2、本发明提供了nk细胞外泌体(nk-exos)联合nk细胞在制备三阴性乳腺癌预防或治疗的药物组合物中的应用。
3、进一步，所述nk细胞外泌体通过过口服施用、栓剂施用、病灶周围施用、病灶表面施用、局部点用、静脉施用、肠胃外施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用。
4、进一步，所述nk细胞通过过口服施用、栓剂施用、病灶周围施用、病灶表面施用、局部点用、静脉施用、肠胃外施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用。
5、进一步，所述nk细胞外泌体的施用方式为静脉注射。
6、进一步，所述nk细胞的施用方式为静脉注射。
7、在一些实施方案中，所述“施用”涉及将药剂实际性物理引入目标生物靶标(例如宿主和/或受试者)中或其上(在适当时)。可在体外或体内将组合物施用于细胞(例如“接触”)。可在体内经由适当施用途径将组合物施用于受试者。根据本发明涵盖将组合物引入宿主中的任何和所有方法。所述方法并不依赖于任何特定引入方式并且不应如此解释。引入方式是本领域技术人员众所周知的，并且也示例于本文中。所述术语包括容许药剂实施其预期功能的施用途径。可使用的用于治疗身体的施用途径的实例包括注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内等)、口服、吸入和透皮途径。注射可为团注或可为连续输注。取决于施用途径，药剂可用所选材料包覆或布置于其中以保护其免受可有害地影响其实施其预期功能的能力的天然条件影响。可单独或联合药学上可接受的载体来施用药剂。药剂也可作为前药施用，前药在体内转化成其活性形式。
8、进一步，所述nk细胞外泌体与nk细胞的比例为100μg：(1×104-1×107)个。
9、在一些实施方案中，所述nk细胞外泌体与nk细胞的比例为100μg：1×104个、100μg：1×105个、100μg：1×106个、100μg：1×107个。
10、进一步，所述药物组合物在应用中按照疗程进行预防或治疗。
11、进一步，所述疗程包括以注射1次nk细胞外泌体、注射1次nk细胞为一个疗程。
12、进一步，所述疗程需要5次以上。
13、进一步，所述nk细胞外泌体与nk细胞的注射交替进行。
14、进一步，所述两次注射之间时间间隔3d。
15、在一些实施方案中，所述nk细胞外泌体与nk细胞的使用间隔为3天，即使用nk细胞外泌体后间隔72小时施用nk细胞。在一些实施方案中，nk细胞外泌体与nk细胞每次的使用均需要静脉注射。在一些实施方案中，所述nk细胞外泌体与nk细胞之间的联合使用需要重复5次以上。在一些实施方案中，所述nk细胞外泌体与nk细胞的联合应用重复5次。
16、进一步，所述三阴性乳腺癌来自人和/或非人个体。
17、进一步，所述三阴性乳腺癌来自人。
18、在一些实施方案中，所述nk细胞通过健康人外周血单核细胞定向诱导培养获得。在一些实施方案中，所述nk细胞外泌体通过nk细胞培养上清通过超速离心法获得。
19、本发明中使用的术语“nk细胞”是指向患者施用nk细胞和/或nk样t细胞。患者可能患有恶性疾病(如乳腺癌)或需要此种疗法的患者。在一些实施方案中，所述nk细胞疗法是指一种细胞疗法，作为活性成分的物质为nk细胞。这种nk细胞可以是同种异体的或自体的。在具体的实施方案中，nk细胞可以通过特定基因的确实或敲除或敲入基因工程化。在一些实施方案中，所述nk细胞包括表达嵌合抗原受体的nk细胞。在一些实施方案中，所述nk细胞可能已经离体扩增或纯化。在一些实施方案中，所述nk细胞可以包含在其他血细胞，例如免疫系统的其他细胞的组合物中。术语“nk细胞”、“记忆性nk细胞”、“自然杀伤细胞”、“自然杀伤(nk)细胞”、“nk”等可互换使用，指一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的nk细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒性作用。
20、在一些实施方案中，所述“治疗”是指疾病或病症或其至少一种可分辨的症状的改善、预防、或逆转。在某些具体的实施方案中，所述“治疗”是指与所要治疗疾病或病症相关的至少一种可测量生理参数的改善、预防、或逆转，所述参数并不一定是哺乳动物中可识别的，或被哺乳动物识别。在一些实施方案中，所述“治疗”是指抑制或减缓疾病或病程，这种抑制或减缓可以是身体上的，如某些可辨别的恶劣症状；这种抑制或减缓可以是生理上的，如稳定生理参数；这种抑制或减缓可以是两者都具备的。
21、本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括预防有效量或治疗有效量的前面所述的应用中nk细胞外泌体和nk细胞。
22、进一步，所述药物组合物还包括药学上的辅剂。
23、进一步，所述辅剂包括赋形剂、稀释剂或其它液体溶媒、分散助剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂。
24、在一些实施方案中，在药物组合物中添加的辅剂包括但不限于：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
25、在一些实施方案中，所述辅剂可以采取本文中已列举的任意一种或多种辅剂，添加辅剂后使得药物组合物可以以被接受的形式被使用，优先使用的被接受形式为注射溶液。
26、本文中所用的术语“治疗有效量”涉及当根据期望的治疗方案给药时，对产生一些期望的治疗效果有效，与合理的收益/风险比率匹配的药物或材料，包含药物的组合物或剂型的量。在一些实施方案中，所述治疗有效量为有效预防、减轻或改善疾病的症状或延长要治疗的受试者的存活的药物的量。将在各个特定情况中对个体需求调节该剂量，所述特定情况包括施用的特定药物，施用途径，治疗的病症，以及治疗的患者。
27、本发明提供了一种药剂盒，所述药剂盒包括：前面所述的应用中nk细胞外泌体和nk细胞。
28、进一步，所述药剂盒还包括使用说明。
29、进一步，所述使用说明中注明将nk细胞外泌体和nk细胞联合应用。
30、进一步，所述使用说明中注明nk细胞外泌体与nk细胞同时给药、分别给药、间隔给药或顺序给药。
31、在一些实施方案中，所述nk细胞外泌体与nk细胞的联合应用可以作为疾病的预防措施，在这种措施下可以用于治疗一些恶性疾病，例如乳腺癌。
32、在一些实施方案中，所述nk细胞外泌体与nk细胞的使用时间可以是同时的、连续的或间隔的。在一些实施方案中，nk细胞外泌体与nk细胞限制/不限制使用浓度。
33、本发明中使用的术语“预防”，是指通过提前施用的方式降低获得某种疾病或病症的风险，也可指维持或逆转原本要恶化的疾病的病症，预防病症的恶化，尽管还未表现出该病症的症状。
34、本发明提供了前面所述的应用中nk细胞外泌体和nk细胞在制备抑制三阴性乳腺癌细胞或组织、促进三阴性乳腺癌细胞凋亡的产品中的应用。
35、本发明提供了nk细胞外泌体和nk细胞在制备提高nk细胞对乳腺癌的抑制或杀伤能力的产品中的应用。
36、进一步，所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。
37、本发明中使用的术语“杀伤能力”是指通过使所述细胞接触有效量的抗体、t细胞、nk细胞、免疫缀合物、双特异性/多特异性分子或组合物从而杀伤细胞来实现。例如，本技术的nk细胞和nk细胞外泌体可以增强对肿瘤细胞的杀伤能力。
38、本发明提供了一种体外非治疗目的的抑制三阴性乳腺癌细胞或组织的方法，所述方法包括将前面所述的药物组合物或前面所述的药剂盒使用到体外三阴性乳腺癌细胞或组织上的步骤。
39、本发明提供了一种三阴性乳腺癌细胞抑制率的检测方法，所述方法包括：
40、向rtca的含有三阴性乳腺细胞株检测板中先加入dmem培养基测定背景阻抗值，收集对数期细胞调整细胞悬液以8000个细胞加入检测板，室温静置，观察至细胞沉入检测板底部时，将该检测板放入通电的检测台上进行实时动态的细胞增殖检测，细胞增殖至index值接近于1时，向培养孔中加入nk细胞+nk-exos，进实时动态检测至干预后72 h以上的增长曲线，计算在24 h、48 h、72 h的抑制率，分析nk-exos和nk细胞作用下的细胞效应曲线；
41、收集对数期细胞调整细胞悬液以8000个细胞加入孔板中，放置于培养箱待细胞融合率约为60％～70％时，向培养孔中加入nk细胞+nk-exos，在干预后的48 h时，向孔中加入cck-8检测试剂，于37℃孵育4 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度，计算细胞抑制率：抑制率(％)＝(对照组od值-实验组od值/对照组od值)×100％。
42、进一步，所述nk细胞+nk-exos的加入量为1×104个nk+10μgnk-exo/孔。
43、本发明的优点和有益效果：
44、本发明的目的是为了解决现有技术中三阴性乳腺癌治所使用的化疗效果差、靶向治疗缺乏明确治疗靶点、细胞的免疫治疗免疫原性差及安全性低的问题，实现肿瘤特异性靶向并规避不良反应，为三阴性乳腺癌的临床治疗提供新的方向和方案。
45、(1)nk-exos影响了肿瘤细胞被免疫细胞捕获与杀伤的效果，也提示nk-exos可能不仅可以作为一种单独的治疗手段，也可以作为nk细胞治疗的辅助手段，与nk细胞联合应用能够增强细胞治疗的疗效。
46、(2)nk-exos在无肿瘤小鼠体内主要聚集与肝脏，nk-exos在乳腺癌荷瘤小鼠的肝脏和靶肿瘤中表现出显著的高摄取和聚集。
47、(3)nk-exos联合nk细胞对肿瘤的抑制效果要优于单独使用nk细胞治疗，且没有引起显着的体内毒性。
48、本技术开创性尝试使用nk-exos联合nk细胞治疗三阴性乳腺癌的方案，结合体内外实验证明nk-exos与nk细胞的联合应用能够显著抑制肿瘤的增长，并且在小鼠体内具有安全性。
1.nk细胞外泌体联合nk细胞在制备三阴性乳腺癌预防或治疗的药物组合物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述nk细胞外泌体通过过口服施用、栓剂施用、病灶周围施用、病灶表面施用、局部点用、静脉施用、肠胃外施用、腹腔施用、肌肉施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用；
3.根据权利要求1所述的应用，所述nk细胞外泌体与nk细胞的比例为100μg：(1×104-1×107)个；
4.一种药物组合物，所述药物组合物包括预防有效量或治疗有效量的权利要求1-3任一项所述的应用中nk细胞外泌体和nk细胞。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，所述药物组合物还包括药学上的辅剂；
6.一种药剂盒，所述药剂盒包括：权利要求1-3任一项所述的应用中nk细胞外泌体和nk细胞；
7.权利要求1-3任一项所述的应用中nk细胞外泌体和nk细胞在制备抑制三阴性乳腺癌细胞或组织、促进三阴性乳腺癌细胞凋亡的产品中的应用。
8.nk细胞外泌体和nk细胞在制备提高nk细胞对乳腺癌的抑制或杀伤能力的产品中的应用；
9.一种体外非治疗目的的抑制三阴性乳腺癌细胞或组织的方法，所述方法包括将权利要求4或5所述的药物组合物或权利要求6所述的药剂盒使用到体外三阴性乳腺癌细胞或组织上的步骤。
10.一种三阴性乳腺癌细胞抑制率的检测方法，所述方法包括：
