本发明属于海洋生物及医药，具体地说，涉及一种从两株北极真菌弯孢聚壳属真菌d-1和丛赤壳属真菌b-13混合发酵产物中经固体培养基发酵、提取、分离纯化得到氯代海松烷二萜化合物及其在制备抗紫外线眼病药物中的应用。
背景技术：
1、中波紫外线(ultraviolet b，uv-b)辐射是紫外线眼病的主要致病因素，uv-b通过促进人角膜上皮细胞dna氧化和凋亡诱导角膜炎、结膜炎、白内障、翼状胬肉、黄斑病变等眼部疾病的发生，寻找有效的紫外线眼病治疗药物是一项重要的医学课题。真菌微生物次级代谢产物种类多、结构新、活性强，是临床小分子药物的重要来源。近年来随着极地科考事业的发展，对极地真菌适应严苛气候的物质基础和药用前景的研究受到了广泛关注。药源材料eutypella sp.d-1分离自北极，隶属于子囊菌门ascomycetes、炭角菌目xylariales、胶孢壳科diatrypaceae、弯孢聚壳属eutypella，文献报道该种属的次级代谢产物主要包括倍半萜、二萜、甾体、苯并吡喃衍生物、内酯类以及细胞松弛素类化合物等，部分化合物显示了与抗紫外线眼病相关的生物活性，如抗氧化、抗炎等；另一药源材料nectria sp.b-13也分离自北极，属于子囊菌门ascomycota、肉座菌目hypocreales、丛赤壳科nectriaceae、丛赤壳属nectria，从该属真菌中分离到的次级代谢产物主要有氯代酚类倍半萜、单酚类、聚酮化合物、甾醇以及生物碱类等，部分化合物显示了抗细菌、抗炎、抗氧化等生物活性。如从eutypella属真菌中分离得到的海松烷二萜化合物eutypellenonea有非常良好的与紫外线眼病治疗相关的抗炎与抗氧化活性(参见文献：yu h-b,wang x-l,zhang y-x,etal.libertellenones o–s and eutypellenones a and b,pimarane diterpenederivatives from the arctic fungus eutypellasp.d-1[j].journal ofnaturalproducts,2018,81(7):1553-60.)。
2、至今未见从产自两株北极真菌弯孢聚壳属真菌d-1和丛赤壳属真菌b-13混合发酵产物中分离得到具有紫外线眼病治疗作用的氯代海松烷二萜化合物的报道。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种从两株北极真菌弯孢聚壳属真菌d-1和丛赤壳属真菌b-13混合发酵产物中经提取、分离纯化得到新的氯代海松烷二萜化合物。
2、本发明的另一个目的是提供一种所述氯代海松烷二萜化合物的提取方法。
3、本发明的再一个目的是提供一种所述氯代海松烷二萜化合物在制备抗紫外线眼病药物中的应用。
4、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
5、本发明的第一方面，提供了一种氯代海松烷二萜化合物或其药用盐，其化学结构如式(i)所示：
6、
7、所述氯代海松烷二萜化合物是从两株北极真菌弯孢聚壳属真菌d-1和丛赤壳属真菌b-13混合发酵产物中经提取、分离纯化得到。
8、本发明的第二方面，提供一种所述氯代海松烷二萜化合物的提取方法，包括以下步骤：
9、第一步、制备总提物：
10、从保种平板上挑取丛赤壳属真菌nectria sp.b-13菌丝体，接种到含有pdb培养基的摇瓶中，温度为25～30℃(优选为28℃)的条件下震荡培养3～7天(优选5天)，得到一级种子液，取一级种子液转接到含有种子培养基的摇瓶中，在相同条件下培养1～3天(优选为2天)得到二级种子液；
11、采用上述相同的方法得到保藏编号为cctcc no：m 2013144的弯孢聚壳菌eutypellasp.d-1的二级种子液；
12、取nectria sp.b-13二级种子液转接到含有发酵培养基的摇瓶中，进行扩大培养，温度为25～30℃(优选为28℃)的条件下震荡培养1～2天(优选1天)，取eutypella sp.d-1的二级种子液转接到上述摇瓶中，在相同条件下混合发酵10天；
13、将上述培养得到的发酵液过滤，分别获得菌体和菌液；菌液用等体积乙酸乙酯萃取至少3次，合并萃取液蒸干溶剂得到第一部分浸膏；菌体用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇超声提取至少3次，浓缩提取液至无有机溶剂，加水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取至少3次，合并萃取液蒸干溶剂得到第二部分浸膏；将上述第一部分浸膏和第二部分浸膏合并获得总提物；
14、第二步，分离纯化：
15、①将上述总提物经减压液相柱色谱vlc，以石油醚:乙酸乙酯(100:1，80:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，1:1，0:1，v/v)为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到15个组分fr.a-o；
16、②组分fr.k经正相硅胶柱色谱，以石油醚:乙酸乙酯(25:1，15:1，10:1，5:1，3:1，2:1，meoh，v/v)为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc显色分析合并相似流分得到5个组分fr.k1-k5；
17、③对组分fr.k4进行反相高效液相色谱纯化，得到式(i)所示化合物。
18、所述pdb培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
19、所述种子培养基配方为：葡萄糖125g/l，硝酸钠3.3g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，酵母提取物0.7g/l，六水氯化钴3.125mg/l，硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，l-鸟氨酸盐酸盐15g/l。
20、所述发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l。
21、所述取nectria sp.b-13二级种子液转接到含有发酵培养基的摇瓶中，nectriasp.b-13二级种子液按照5％v/v的接种量接种。
22、所述对组分fr.k4进行反相高效液相色谱纯化条件：以甲醇/水(33:67，0.1％甲酸)体系，在流速为2ml/min的条件下进行分离制备，检测波长为305nm，保留时间为34分钟。
23、本发明的第三方面，提供一种所述氯代海松烷二萜化合物或其药用盐在制备抗紫外线眼病药物中的应用。
24、所述抗紫外线眼病药物是指以所述氯代海松烷二萜化合物或其药用盐作为单一活性成分作为抗紫外线眼病药物或以所述氯代海松烷二萜化合物或其药用盐与其他药物载体、其他抗紫外线眼病药物一起组合成为抗紫外线眼病药物。
25、本发明的第四方面，提供一种所述氯代海松烷二萜化合物或其药用盐在制备预防或治疗uvb辐射引起的眼角膜损伤的药物中的应用。
26、由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
27、本发明获得的化合物是首次发现的氯代原子的海松烷二萜类化合物。体外活性试验证明，化合物在20μm作用浓度下对人眼角膜上皮细胞(hce-t细胞)具有uvb辐照保护作用，并且通过abts法抗氧化能力检测，表明该化合物具有较强的抗氧化能力，可能通过减少uvb引起细胞内氧化应激来提高细胞活力。因此，可用于开发制备新型抗紫外线眼病药物，用于预防或治疗uvb辐射引起的眼角膜损伤的药物。
28、本发明为研究和开发新的抗紫外线眼病药物提供了新的先导化合物，为开发利用极地海洋药用资源提供了科学依据。
29、本发明的氯代海松烷二萜化合物是从两株北极真菌弯孢聚壳属真菌d-1和丛赤壳属真菌b-13混合发酵产物中经提取、分离纯化得到。
30、生物材料样品的保藏信息：
31、保藏单位：中国典型培养物保藏中心
32、地址：中国.武汉.武汉大学
33、保藏日期：2013年4月12日
34、保藏编号：cctcc no：m2013144
35、分类命名：弯孢聚壳菌d-1eutypella sp.d-1
36、生物材料样品的保藏信息：
37、保藏单位：中国典型培养物保藏中心
38、地址：中国.武汉.武汉大学
39、保藏日期：2024年6月21日
40、保藏编号：cctcc m 20241339
41、分类命名：丛赤壳属b-13nectria sp.b-13
1.一种氯代海松烷二萜化合物或其药用盐，其特征在于，其化学结构如式(i)所示：
2.根据权利要求1所述的氯代海松烷二萜化合物或其药用盐，其特征在于，所述氯代海松烷二萜化合物是从两株北极真菌弯孢聚壳属真菌d-1和丛赤壳属真菌b-13混合发酵产物中经提取、分离纯化得到。
3.一种权利要求1或2所述的氯代海松烷二萜化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的氯代海松烷二萜化合物的提取方法，其特征在于，所述pdb培养基配方为：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
5.根据权利要求3所述的氯代海松烷二萜化合物的提取方法，其特征在于，所述种子培养基配方为：葡萄糖125g/l，硝酸钠3.3g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，酵母提取物0.7g/l，六水氯化钴3.125mg/l，硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，l-鸟氨酸盐酸盐15g/l。
6.根据权利要求3所述的氯代海松烷二萜化合物的提取方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l。
7.根据权利要求3所述的氯代海松烷二萜化合物的提取方法，其特征在于，所述取nectria sp.b-13二级种子液转接到含有发酵培养基的摇瓶中，nectria sp.b-13二级种子液按照5％v/v的接种量接种。
8.根据权利要求3所述的氯代海松烷二萜化合物的提取方法，其特征在于，所述对组分fr.k4进行反相高效液相色谱纯化条件：以甲醇/水(33:67，0.1％甲酸)体系，在流速为2ml/min的条件下进行分离制备，检测波长为305nm，保留时间为34分钟。
9.一种权利要求1或2所述的氯代海松烷二萜化合物或其药用盐在制备抗紫外线眼病药物中的应用。
10.一种权利要求1或2所述的氯代海松烷二萜化合物或其药用盐在制备预防或治疗uvb辐射引起的眼角膜损伤的药物中的应用。
