本发明属于农业微生物、分子生物学，具体涉及一种能够高度耐盐促生的卡鲁姆木霉工程菌及其构建方法与应用。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、gcn5是最早被鉴定出来的组蛋白乙酰化酶之一，最初是从氨基酸合成缺陷的酵母突变体中鉴定出来的。在酿酒酵母、曲霉菌以及木霉菌的研究中表明，gcn5对于维持全基因组组蛋白乙酰化的基础水平具有决定性的作用，但是其在丝状真菌生长发育、代谢调控等方面的功能研究还比较少。
3、木霉(trichoderma spp.)属于半知菌类的丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、木霉属，广泛分布于自然界中，是组成土壤微生物群落的重要部分。木霉是一种多功能的丝状真菌，在植物促生抗逆、生物防治、纤维素酶生产和生物质利用等方面有着广泛用途。
4、木霉菌作为木霉菌剂已经广泛认可，对植物的促生具有重要的作用。近年来越来越多的报道指出，木霉菌还能促进宿主植物生长发育，提高植物耐受非生物胁迫的能力。且木霉生长迅速，对营养物质要求低，适应应力强。因此，木霉已经被制成孢子粉、发酵液等多种制剂，广泛应用于农业生产中。
5、已登记的木霉菌剂，主要在用在土壤(有机肥)和中种子(包衣)处理，然而在含盐量过高的土壤中，严重降低了木霉的生长速度和生殖速度，影响了木霉菌的活性，从而降低的木霉菌剂对苜蓿的促生作用。
6、木霉体内代谢途径丰富，代谢产物繁多，其基因转录和表达受到复杂而严格的调控。利用基因组分析和基因工程技术，发掘木霉中重要的代谢突进和功能基因，是对木霉进行遗传改良的有效途径。木霉在应用于工农业生产中，不可避免的要面对一些自然环境和发酵环境中的一些不利影响，如高温、高盐等，这直接影响木霉的生存，进而影响其农业防治效果和工业生产能力。因此，提高木霉对不利环境的适应能力，对木霉菌在工农业上的应用有重大的意义。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种能够高效耐盐促生的卡鲁姆木霉工程菌及其构建方法与应用。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本发明请求保护核苷酸序列如sdq id no.1所示的组蛋白乙酰转移酶基因gcn5或所述组蛋白去乙酰化酶基因gcn5的过表达片段在提高卡鲁姆木霉耐盐性或构建耐盐卡鲁姆木霉工程菌中的应用。
4、第二方面，本发明请求保护上述组蛋白乙酰转移酶基因gcn5的过表达片段，该过表达片段包含核苷酸序列如sdq id no.2示的强启动子基因pcdna1和核苷酸序列如sdq idno.1所示组蛋白乙酰转移酶基因gcn5。该过表达片段能够在卡鲁姆木霉中异源表达，形成具有活性的组蛋白乙酰转移酶。
5、进一步，该过表达片段还包括潮霉素b抗性片段，所述过表达片段的核苷酸序列如sdq id no.4所示。
6、所述组蛋白乙酰转移酶基因gcn5来自绿色木霉tv-1511的基因组，其ncbi基因数据库的登录号为mz338376。所述绿色木霉tv-1511的菌株保藏号为cgmccno.16800，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述组蛋白乙酰转移酶基因gcn5编码蛋白的氨基酸序列如sdq id no.3所示。
7、所述强启动子基因pcdna1来自里氏木霉(trichiderma.reesei qm9414)atcc26921的基因组，其核苷酸序列如sdq id no.2示。
8、第三方面，本发明请求保护一种耐盐卡鲁姆木霉工程菌，是将上述的过表达片段转化卡鲁姆木霉菌得到的。该卡鲁姆木霉工程菌能够过量表上述的组蛋白去乙酰化转移酶基因gcn5。
9、更进一步，所述转化的方法为原生质体转化(peg-cacl2法)，并通过潮霉素b抗性基因筛选。
10、第四方面，本发明请求保护一种耐盐卡鲁姆木霉工程菌的构建方法，获得潮霉素b的抗性片段、如sdq id no.2示的强启动子基因pcdna1片段和如sdq id no.1示的组蛋白乙酰转移酶基因gcn5片段，利用pcr技术方法将所获得的片段进行融合得到如sdq id no.4示的组蛋白乙酰转移酶基因gcn5的过表达片段；将所述的过表达片段转化卡鲁姆木霉菌并通过潮霉素抗性基因筛选得到的耐盐卡鲁姆木霉工程菌。
11、本发明的具体实施例中，获得强启动子基因pcdna1片段、组蛋白乙酰转移酶基因gcn5片段和潮霉素b的抗性片段的引物为：
12、pcdan1-f：tctaagccatagtaccctcgagcagacaatgatggtagcagcgc；
13、pcdan1-r：ctctcttctttaacgtcagccatatcgatgagagaagttgttggatt；
14、gcn5-f：aatccaacaacttctctcatcgatatggctgacgttaaagaagagag；
15、gcn5-r：cttctccggctcgagatg；
16、hygb-f：ggatccgagagctaccttacatc；
17、hygb-r：gcgctgctaccatcattgtctgctcgagggtactatggcttaga；
18、第五方面，本发明请求保护上述的耐盐卡鲁姆木霉工程菌在制备以功能木霉为主的微生物菌剂中的应用。
19、第六方面，本发明请求保护一种提高卡鲁姆木霉菌在盐环境中对植物促生作用的方法，是将上述的过表达片段转化卡鲁姆木霉菌得到的耐盐卡鲁姆木霉工程菌，再采用所述的耐盐卡鲁姆木霉工程菌在盐环境中处理目标植物促进目标植物的生长。
20、本发明的具体实施例中，所采用的卡鲁姆木霉菌为保藏号为cctcc no：m20241303的卡鲁姆木霉菌菌株nau-dy2。
21、第七方面，本发明请求保护一种卡鲁姆木霉菌菌株nau-dy2，该菌株nau-dy2分类命名为卡鲁姆木霉菌(trichoderma harzianum)，于2024年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20241303，保藏地址为：中国武汉大学。
22、本发明的有益效果：
23、针对目前大部分木霉菌株耐盐能力弱，本发明构建了一种具有高耐盐能力的卡鲁姆木霉工程菌。该工程菌异源表达了绿色木霉菌tv-1511基因组的组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，hat)gcn5，具有高耐盐的能力，并且在高度含盐的环境中对苜蓿幼苗有明显的促生效果。本发明能够促进木霉菌在农业和生产实践中的应用。
1.核苷酸序列如sdq id no.1所示的组蛋白乙酰转移酶基因gcn5或所述组蛋白去乙酰化酶基因gcn5的过表达片段在提高卡鲁姆木霉耐盐性或构建耐盐卡鲁姆木霉工程菌中的应用。
2.权利要求1中所述组蛋白乙酰转移酶基因gcn5的过表达片段，其特征在于，该过表达片段包含核苷酸序列如sdq id no.2示的强启动子基因pcdna1和核苷酸序列如sdq idno.1所示组蛋白乙酰转移酶基因gcn5。
3.根据权利要求2所述的过表达片段，其特征在于，该过表达片段还包括潮霉素b抗性片段，所述过表达片段的核苷酸序列如sdq id no.4所示。
4.一种耐盐卡鲁姆木霉工程菌，其特征在于，是将权利要求2或3所述的过表达片段转化卡鲁姆木霉菌得到的。
5.根据权利要求4所述的耐盐促生的卡鲁姆木霉工程菌，其特征在于，所述转化的方法为原生质体转化，并通过潮霉素抗性基因筛选。
6.一种耐盐卡鲁姆木霉工程菌的构建方法，其特征在于，获得潮霉素b的抗性片段、如sdq id no.2示的强启动子基因pcdna1片段和如sdq id no.1示的组蛋白乙酰转移酶基因gcn5片段，利用pcr技术将所获得的片段进行融合得到如sdq id no.4示的组蛋白乙酰转移酶基因gcn5的过表达片段；将所述的过表达片段转化卡鲁姆木霉菌并通过潮霉素抗性基因筛选得到的耐盐卡鲁姆木霉工程菌。
7.权利要求4或5所述的耐盐卡鲁姆木霉工程菌在制备以功能木霉为主的微生物菌剂中的应用。
8.一种提高卡鲁姆木霉菌在盐环境中对植物促生作用的方法，其特征在于，是将权利要求2或3所述的过表达片段转化卡鲁姆木霉菌得到的耐盐卡鲁姆木霉工程菌，再采用所述的耐盐卡鲁姆木霉工程菌在盐环境中处理目标植物促进目标植物的生长。
9.权利要求1中所述的应用，权利要求4或5中所述的耐盐卡鲁姆木霉工程菌，权利要求6所述的构建方法，权利要求7中所述的应用，或权利要求8中所述的方法，其特征在于，所述的卡鲁姆木霉菌为保藏号为cctcc no：m 20241303的卡鲁姆木霉菌菌株nau-dy2。
10.一种卡鲁姆木霉菌菌株nau-dy2，该菌株nau-dy2分类命名为卡鲁姆木霉菌(trichoderma harzianum)，于2024年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20241303，保藏地址为：中国武汉大学。
