本发明属于生物传感分析，特别涉及一种基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板及其构建、传感方法和应用。
背景技术：
1、镁(mg2+)离子是存在于环境和细胞中的一种丰富的二价阳离子。在环境中，高水平的mg2+对植物具有一定毒性，可以增强作物吸收营养过程中离子之间的拮抗作用；而镁缺乏会影响植物的生长发育，导致农业生产力和质量下降。就细胞内而言，mg2+参与各种生理功能的基本元素和细胞过程，并直接参与多种生物活性，因此，mg2+的失衡会导致许多疾病，如肾功能受损和肾功能衰竭、肌肉痉挛和抽搐、糖尿病、支气管哮喘、神经肌肉问题、心血管疾病和高血压。因此，定量检测自然界或者生物体内mg2+的含量意义非凡。
2、目前，常用的mg2+检测方法包括原子吸收光谱(aas)、电感耦合等离子体原子发射光谱(icp-ms)和紫外可见光谱，但这些方法普遍存在生产成本高、操作复杂、环境干扰大等问题，因而无法满足传感检测的普适性标准。近年来，荧光法、比色法、电化学发光法、表面增强拉曼光谱法、电化学法等被用于构建mg2+的传感平台并取得了显著的成绩。其中，电化学传感器因价格优异、灵敏度高、便携、响应时间快等优点而被广泛关注，是实现mg2+快速、灵敏、实时监测的首选方法。
3、近年来，在电极表面引入高灵敏信号放大策略成为构建高效响应金属离子的电化学传感器的主要手段。其中，杂交链反应(hcr)是一种脚趾介导的链置换(tmsd)反应，该扩增法不包含酶反应，并且扩增效率高、动力学可控，因此备受研究者的欢迎。对于典型的tmsd反应，其引发剂是互补的单链悬垂区域(即脚点)，触发反应后短单链dna被长单链dna(ssdna)取代，而后与第三条链杂交，形成具有更多互补碱基对的双螺旋结构。其中，脚点区域的碱基数量和种类决定了链转移过程中的动力学大小，其链位移速度可加快至106倍。相较于传统的信号放大方法，如聚合酶链式反应(pcr)、环介导等温扩增(lamp)、链置换扩增(sda)和滚环扩增(rca)，hcr具有良好的抗干扰能力，操作过程简单，可用于复杂的实际样品中的靶标检测以及活细胞甚至生物体内的生物成像，应用前景广泛。
4、dnazyme的发现进一步扩增了信号放大策略的队伍。dnazyme是一种重要的核酸，具有令人着迷的催化功能。dnazyme作为一种核酸可以模拟蛋白质酶的功能，催化包括dna链的连接和裂解等化学反应。研究表明，基于dnazyme扩增的多重信号放大策略更有助于实现目标分子的超灵敏检测。
5、本发明将上述两种放大手段结合，形成协同放大效应，并采用电化学传感器进行信号输出，从而实现对mg2+的超灵敏检测。
技术实现思路
1、本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种mg2+高灵敏检测的hcr-dnazyme扩增开关微孔板，其构建、传感方法和应用，该微孔板采用了hcr和dnazyme扩增策略作为信号放大手段，采用电化学信号作为传感方式，又充分利用了微孔板的操作便捷性，在微孔板内成功实现了mg2+的高灵敏定量检测。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种hcr-dnazyme扩增结构，由ldna-biotin、发卡dna h1、发卡dna h2、发卡dnah3、发卡dna h4、发卡dna h5/ra/-mb杂交而成；
4、所述ldna-biotin的序列为：ccc taa ccc taa ccc taa gcc ggc cgc ggg cccgcg ttt ttt-biotin，如seq no.6所示；所述biotin为修饰在ldna上的生物素；
5、h1的序列为：cgc ggg ccc gcg gcc ggc tta ggg tta ggg tta ggg cat accgct tca tct tca tct ctc tag gca ccc t gtt acaact acc gtc cgt，序列如seq no.1所示；
6、h2的序列为：gta ccg ttc ga gc gct ctt gcg atc caa gct tca tct tca tctctc gtt ttg gag aga tgaaga tgaagc ggt atg，如seq no.2所示；
7、h3的序列为：gta ccg ttc ga gc gct ctt gcg atc cta caa aac gag aga tgaaga tga agc aac cag gct tca tct tca tct ctc，如seq no.3所示；
8、h4的序列为：ccc taa ccc taa ccc taa gcc ggc cgc ggg ccc gcg ttt tttgag aga tgaaga tga agc ctg gtt ttg gca ccc t gtt acaact acc gtc cga，如seqno.4所示；
9、h5/ra/-mb的序列为：ccc gcc gc acg gac ggt agt tgt aac a/ra/aag agc gcag gaa cgg tac gcg gcg gg-mb，如seq no.5所示；所述mb为修饰在发卡dna h5上的亚甲基蓝；ra为修饰在发卡dna h5上的mg2+特异性切割结构，所述mg2+特异性切割结构遇到mg2+时，结构发生特异性变形，释放mb修饰的dna片段，具有电化学信号。
10、一种基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板，包括固定在链霉亲和素包被的微孔板板底的hcr-dnazyme扩增结构。
11、所述hcr-dnazyme扩增结构的构建方法，包括以下步骤：
12、步骤1，在缓冲液内依次投入所述ldna-biotin、h1、h2和h3进行杂交；
13、步骤2，在步骤1制得的溶液中依次加入h4、h5/ra/-mb进行杂交，制得所述hcr-dnazyme扩增结构。
14、优选地，所述步骤1中，在缓冲液内依次投入4个体积单位的ldna-biotin、8个体积单位的h1、8个体积单位的h2和8个体积单位的h3进行杂交，确保该体系的终体积为100个体积单位；所述步骤2中，加入8.7个体积单位的h4和1.8个体积单位的h5/ra/-mb；
15、所述ldna-biotin、h1、h2、h3、h4、h5/ra/-mb的摩尔浓度比为10:1:1:1:1:10。
16、优选地，所述步骤1和2中，杂交条件为：37℃恒温水浴震荡器内孵育2h，然后进行终止反应操作。更优选地，所述终止反应操作条件为：置于4℃冰箱，4h。终止反应的作用是固定已经形成的hcr结构和dnazyme的活性。
17、优选地，所述缓冲液为1×tae(2m三羟甲基氨基甲烷(tris base)、100mm乙二胺四乙酸(edta)，ph＝8.5)，目的是提供杂交所需的ph环境，促进碱基互补配对原则的发生，以构成hcr-dnazyme结构。
18、杂交链式反应(hcr)是一种dna扩增技术，属于一种脚介导的链置换反应。通过环的交叉开环和两个双链dna的自组装形成线性dna纳米结构，其具有无酶特性、高效的等温扩增、超高的灵敏度和结构灵活性等优点。金属离子依赖性dnazyme，可以在特定金属离子作为辅因子的情况下发挥酶的功能，操纵核糖核苷酸的断裂，实现金属离子的特异性反应。hcr和dnazyme的联合应用使具有双无酶信号放大的超灵敏mg2+生物传感器的构建成为可能。
19、一种基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板的构建方法，包括以下步骤：
20、步骤a，在缓冲液内依次投入所述ldna-biotin、h1、h2和发夹h3进行杂交，形成ldna-biotin-h1-h2-h3的结构；
21、步骤b，将所述ldna-biotin-h1-h2-h3的结构固定在链霉亲和素包被的微孔板板底；
22、步骤c，将h4和h5/ra/-mb分别投入步骤b制得的微孔板中杂交，制得所述基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板。
23、优选地，所述步骤b中ldna-biotin-h1-h2-h3的结构加入链霉亲和素包被的微孔板板底，孵育时间为0.5-4h，最佳时间为1h。
24、优选地，所述步骤c中h4加入后，孵育时间为0.5-4h，最佳时间为2h。
25、优选地，所述步骤c中h5/ra/-mb加入后，孵育时间为0.5-1h，最佳时间为1h。
26、优选地，所述基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板的构建方法，具体步骤为：
27、首先，在微孔板前，对96孔板中ldna-biotin的连接饱和量进行探索；按照hcr-dnazyme的构建方法，形成ldna-biotin-h1-h2-h3的结构，经4倍稀释后，于37℃恒温水浴震荡器内孵育，确保其固定在链霉亲和素包被的的96孔板板底，然后将h4(10μm,8.7μl)和h5/ra/-mb(100μm,1.8μl)依次投入孔板中孵育2h，过程中清洗掉未连接的链。
28、hcr-dnazyme扩增开关构建于底部修饰有链霉亲和素的96孔板内。在链霉亲和素与生物素的特异性结合下，hcr-dnazyme结构被固定在96孔板板底。
29、所述hcr-dnazyme扩增结构、基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板在mg2+检测检测中的应用。
30、优选地，所述基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板在mg2+检测检测中的应用方法为：
31、步骤ⅰ：在所述基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板内加入待测样品，置于37℃下孵育2h；所述hcr-dnazyme扩增开关包含的mg2+特异性切割结构，待测水样中的mg2+使其结构发生特异性变形，释放mb修饰的dna片段，具有电化学信号；
32、步骤ⅱ：取扩增微孔板的上清液，滴在修饰有捕获cdna-sh的ito电极，利用碱基互补配对原则进行目标dna的捕获；所述cdna-sh的序列为：cc cgc cgc gtaccg ttc c tgcgct ctt-sh，如seq no.7所示；所述sh为修饰在cdna上的巯基；
33、步骤ⅲ：利用电化学传感器对mb电化学信号进行信号输出，实现微孔板的传感过程。
34、所述步骤ⅲ中，工作电极采用所述修饰有捕获cdna-sh的ito电极。
35、优选地，所述修饰有捕获cdna-sh的ito电极的修饰方法为：
36、在预处理后的ito/au电极上，将20μl不同浓度的cdna-sh溶解在tae中，滴在ito/au表面；孵育2h后，电极用超纯水洗涤，然后浸入1mm 6-巯基-1-己醇(mch)水溶液中；1h后，用超纯水清洗。
37、步骤ⅲ中，所述电化学传感器采用电化学工作站，选用辰华电化学工作站。
38、通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
39、1、本发明采用hcr-dnazyme双重信号放大模式，在结构稳定的基础上实现对痕量mg2+的超灵敏检测；具有超高的响应灵敏度和广阔的线性检测范围。
40、2、本发明以微孔板的形式存在，为实际样品的检测提供了便捷。此外，微孔板还可以量身定制，以满足更多目标客户的特定需求，从而覆盖更多的消费者。具备价格低廉、便携、响应时间快等优点。
41、3、链霉亲和素包被的96孔板的应用有助于降低传感背景信号。链霉亲和素是一种四聚体蛋白，能够与生物素分子高度特异性地结合，具有高度的选择性和稳定性。避免了非生物素化的物质与孔板的结合，从而减少了非特异性吸附和背景信号的干扰。
1.一种hcr-dnazyme扩增结构，其特征在于，由ldna-biotin、发卡dnah1、发卡dnah2、发卡dnah3、发卡dnah4、发卡dnah5/ra/-mb杂交而成；
2.一种基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板，其特征在于，包括固定在链霉亲和素包被的微孔板板底的如权利要求1所述的hcr-dnazyme扩增结构。
3.如权利要求1所述的hcr-dnazyme扩增结构的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，在缓冲液内依次投入4个体积单位的ldna-biotin、8个体积单位的h1、8个体积单位的h2和8个体积单位的h3进行杂交，确保该体系的终体积为100个体积单位；所述步骤2中，加入8.7个体积单位的h4和1.8个体积单位的h5/ra/-mb；
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1和2中，杂交条件为：37℃恒温水浴震荡器内孵育2h，然后进行终止反应操作。
6.一种如权利要求2所述的基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
8.如权利要求1或2所述的所述hcr-dnazyme扩增结构、基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板在mg2+检测检测中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基于hcr-dnazyme扩增开关的微孔板在mg2+检测检测中的应用方法为：
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述修饰有捕获cdna-sh的ito电极的修饰方法为：在预处理后的ito/au电极上，将cdna-sh修饰在ito/au表面。
