本发明涉及植物基因工程，特别涉及一种创制无脱落层芒果种质的方法。
背景技术：
1、芒果是我国第三大热带水果，芒果产业在我国热带亚热带地区农业经济发展中占据重要地位。水泡病是我国芒果最严重的生理性病害之一。每年因为水泡病造成的损失占芒果产量的20％左右。造成水泡病的主要原因是芒果果实钙含量缺乏。由于芒果果肉缺乏钙，芒果果肉细胞在生长和分裂的过程中细胞壁变薄或破裂，细胞内含物外渗，导致水泡病。果面喷施或叶面喷施钙元素不能显著提高果实钙含量。土壤中的钙通过蒸腾作用从根系转运至茎秆，然后通过果柄进入果实。但是在芒果果柄部位存在脱落层，脱落层没有木质部和韧皮部，只有几层排列紧致的细胞，钙离子在这里停止运输，导致大量的钙离子在芒果果柄部位积累，土壤增施钙肥也无法增加果肉钙含量，芒果水泡病无法得到解决。目前，缺乏无脱落层芒果种质，因此，提出一种创制无脱落层芒果种质的方法，可以有效填补本领域的技术空白。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种创制无脱落层芒果种质的方法，利用本发明创制的无脱落层芒果种质钙离子运输没有障碍，在常规田间管理的情况下，果实钙元素含量充足，没有水泡病发生。
2、为了达到以上目的，本发明方案如下：
3、一种创制无脱落层芒果种质的方法，包括以下步骤：对seq id no.1所示的基因序列进行基因编辑。
4、优选的，所述基因编辑的靶点分别位于seq id no.1所示的基因的5‘端或3‘端。更具体的，所述基因编辑的靶点序列为seq id no.1所示的基因序列中的caagaagattgataacgtgacgg和/或aatgtttgcagctgcggcagcgg。
5、在具体的实施例中，发明人对位于5‘端编辑靶点的编辑效果和位于3‘端编辑靶点的编辑效果进行了对比。发现在5‘端的靶点进行编辑时，获得的突变体果柄脱落层完全消失，果实没有水泡病发生。在3‘端进行编辑时，获得的突变体脱落层也消失，但是仍然能够看到模糊的脱落层遗迹，后代果实中也有零星的水泡病发生。因此，在5‘端靶点进行编辑的效果优于在3‘端靶点进行编辑的效果。
6、优选的，所述的创制无脱落层芒果种质的方法，包括以下步骤：
7、(1)针对靶点序列，设计引物，进行引物变性和退火处理，形成寡聚核苷酸；
8、(2)将寡聚核苷酸插入中间载体sk-grna，转化大肠杆菌，提取质粒；提取的质粒进行酶切后纯化回收获得目标序列；将质粒pc1300-cas9进行酶切后纯化回收；
9、(3)将从质粒酶切下来的目标序列通过t4 dna连接酶插入酶切后的质粒pc1300-cas9中，形成基因编辑载体；
10、(4)将基因编辑载体转化进入根癌农杆菌，然后对芒果胚性愈伤组织进行侵染，将侵染后的愈伤组织进行培养，得到转基因植株，筛选得到基因编辑成功的株系，即得到果柄脱落层消失的芒果种质。
11、优选的，步骤(1)中所述引物为：5’-ggcacaagaagattgataacgtga-3’和5’-aaactcacgttatcaatcttcttg-3’，或，5’-ggcaaatgtttgcagctgcggcag-3’和5’-aaacctgccgcagctgcaaacatt-3’。(大写字母为载体序列；小写字母为目的基因序列)
12、优选的，步骤(2)中，提取的质粒采用bgl ii和kpn i进行酶切；质粒pc1300-cas9采用bam hi和kpn i进行酶切。
13、优选的，所述芒果的品种包括“金煌、“凯特。
14、优选的，步骤(4)为：
15、将基因编辑载体转化进入根癌农杆菌，然后对芒果胚性愈伤组织进行侵染，将侵染后的愈伤组织在含有潮霉素的愈伤组织扩繁培养基上进行培养，将新长出的愈伤组织在再生培养基上培养，得到幼苗，得到转基因幼苗，提取幼苗叶片基因组dna进行pcr扩增，能够扩增出hpt ii基因序列的幼苗为转基因植株，进一步筛选得到基因编辑成功的株系，即得到果柄脱落层消失的芒果种质。
16、优选的，所述筛选为：合成引物p7和p8，分别以转基因植株叶片基因组dna和转基因前的芒果植株叶片基因组dna为模板，进行pcr扩增，回收扩增的片段进行测序，与转基因前的芒果扩增片段进行对比，选出基因编辑成功的株系；
17、引物p7和p8的序列为5’-atggcgagagagaagatcaaga-3’和5’-tggaggcgctgcagtactcaaa-3’，或，引物p7和p8的序列为：5’-acacacacacatctcaaggctagtt-3’和5’-gtagtgccaccagccaagacgatat-3’。
18、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19、本发明提供创制无脱落层芒果种质的方法，利用该方法首次成功获得无脱落层芒果新种质，填补相关领域的技术空白。
20、本发明获得的芒果种质果柄没有脱落层，在常规田间管理情况下，果肉钙含量充足，没有水泡病发生，能够消除目前因为水泡病造成的芒果生产损失。
1.一种创制无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：对seq id no.1所示的基因序列进行基因编辑。
2.根据权利要求1所述的创制无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，所述基因编辑的靶点序列为seq id no.1所示的基因序列中的caagaagattgataacgtgacgg和/或aatgtttgcagctgcggcagcgg。
3.根据权利要求2所述的创制无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的创制无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物为：5’-ggcacaagaagattgataacgtga-3’和5’-aaactcacgttatcaatcttcttg-3’，或，5’-ggcaaatgtttgcagctgcggcag-3’和5’-aaacctgccgcagctgcaaacatt-3’。
5.根据权利要求3所述的制创无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，步骤(2)中，提取的质粒采用bgl ii和kpn i进行酶切；质粒pc1300-cas9采用bam hi和kpn i进行酶切。
6.根据权利要求1所述的创制无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，所述芒果的品种包括“金煌、“凯特。
7.根据权利要求3所述的创制无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，步骤(4)为：
8.根据权利要求3所述的创制无脱落层芒果种质的方法，其特征在于，所述筛选为：合成引物p7和p8，分别以转基因植株叶片基因组dna和转基因前的芒果植株叶片基因组dna为模板，进行pcr扩增，回收扩增的片段进行测序，与转基因前的芒果扩增片段进行对比，选出基因编辑成功的株系；
