本发明属于猪的遗传标记筛选与应用，具体涉及一种与猪产肉性状相关的fhl3基因启动子snp分子标记及其应用。所述遗传标记克隆来自猪6号染色体的第93990293碱基处。
背景技术：
1、随着我国经济的稳步增长及人民生活水平的提升，人们对健康、营养丰富且均衡的饮食需求日渐增加。在高质量发展的大背景下，优质动物蛋白的摄入已成为均衡健康饮食的关键组成部分。尤其是猪肉，作为主要的动物性蛋白来源，其需求总量预计仍有很大的增长空间。消费者对猪肉品质也有着更高的标准，不仅仅是营养价值，还包括口感、肉质的细腻程度、脂肪健康指数及其色泽等。在中国畜牧业中，商业猪肉生产正逐渐成为一个全球化的产业。在全球肉类贸易的推动下，各地区在成本控制和产品差异化方面展开了激烈的竞争[1]。因此，选育出快速生长且肉质优异的种猪，不断改进遗传种群，已成为行业的重要趋势。其中，提高猪的生产性能和改善肉质特性成为重点[2]。
2、产肉性状是评价猪肉质量的重要指标，包括背膘厚度、产肉量、肉质评分、生长速度和瘦肉率等。这些性状通常被认为是数量性状，其特点是遗传变异由多个基因位点的累积效应决定。这种微效多基因控制使得育种过程中的选择和评估的遗传机制高度复杂。大多数产肉性状主要由数量性状基因座(quantitative trait loci，qtl)控制，这些基因座在基因组中的分布广泛。通过对qtl的精确定位和连锁分析，可以识别并绘制出影响畜禽经济性状的基因座，包括关键主效基因以及与主效基因紧密连锁的分子标记[3]。主效基因直接调控产肉性状的表现，而分子标记则是基因功能变化的具体原因。随着动物育种进入分子育种阶段，利用基因组信息可以实现更精准的育种。分子标记辅助选择(markerassisted selection，mas)因其高效、成本低且能够保持育种群体遗传稳定的特点，得到了广泛的应用和研究[4]。研究显示，通过qtl定位找到与目标性状相关的基因座后，采用mas技术可以更快速、准确地筛选出携带优良基因的个体，大大提高育种效率和改良效果。因此，识别和选择控制数量性状的qtl，特别是那些影响产肉性状的主效基因及分子标记，对于培养优良品种至关重要。
3、单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，snp)是指在基因组中由单个核苷酸变异引起的多态性，作为一种常见的分子标记，其变异形式包括核苷酸的转换、颠换、插入和缺失。snp可以通过多种机制影响基因功能。在编码区，snp通过直接改变氨基酸序列，从而影响蛋白质的结构和功能。例如，snp可能导致蛋白质功能丧失或获得新的功能，进而引发表型改变。在非编码区，尽管snp不会改变蛋白质序列，但可能通过影响基因表达来发挥作用[2]。它们可以改变转录因子的结合位点，从而影响基因的转录水平，或通过改变表观遗传修饰和染色质结构，间接影响基因表达[4]。在基因调控区域，例如启动子和增强子等区域，snp通过改变这些区域的功能来调控基因表达。例如，启动子区的snp可能影响rna聚合酶的结合效率，从而改变基因的转录起始。
4、研究表明，fhl3与yy1(yin yang 1)dna结合域直接相互作用，阻碍了yy1与快速糖酵解肌肉纤维特异基因myhc2b的结合，从而促进快速糖酵解肌肉纤维的形成[6]。总之，fhl3是一个新的小鼠和猪肌生成调节因子。
5、主要参考文献
6、[1]chen,l.,&huang,y.(2024).global trends in swine production andtrade.
7、international journal of agricultural sustainability,18(1),45–62.
8、[2]wu,j.,&liu,z.(2022).improving pork quality:advances in geneticsandbreeding.meat science,192,108–114.
9、[3]loehlin,d.w.,carroll,s.b.,&waters,p.d.(2020).evolutionary dynamicsofcis-regulatory haplotypes in humans.trends in genetics,36(10),752–762.
10、[4]wang,w.y.,barratt,b.j.,clayton,d.g.,&todd,j.a.(2005).genome-wideassociation studies:theoretical and practical concerns.nature reviewsgenetics,
11、6(2),109-118.
12、[5]ge,y.,chen,j.,&muthusamy,s.(2020).beyond the dark side:the roleoffhl proteins in muscle development and diseases.frontiers in cellanddevelopmental biology,8,568.
13、[6]bai,w.,zhang,y.,ma,j.,du,m.,xu,h.,wang,j.,zhang,l.,li,w.,hou,y.,liu,x.,zhang,x.,peng,y.,li,j.,zhan,x.,jiang,w.,liu,s.,liu,x.,li,q.,miao,y.,sui,m.,yang,y.,zhang,s.,xu,z.,&zuo,b.(2023).fhl3promotesthe formation of fastglycolytic muscle fibers by interacting with yy1andmuscle glycolyticmetabolism.cellular and molecular life sciences,80(1)，2023.
技术实现思路
1、本发明的目标是筛选与猪产肉性状相关联的遗传标记。本研究通过前期实验室探索，发现骨骼肌中fhl3基因表达水平较高，其主要功能在于调节myod介导的肌生成过程[5]。实验结果表明，干涉fhl3表达有利于促进成肌细胞肌管的形成，并显著提高myog的表达水平；相反，fhl3过度表达抑制了myod的转录活性，从而阻碍了肌管的形成。此外，fhl3还具有结合sox15的能力，共同激活foxk1基因的表达，在骨骼肌卫星细胞的增殖和再生过程中发挥重要调节作用。在此基础上，fhl3是一个新的小鼠和猪肌生成调节因子。在fhl3基因启动子区域发现了一个snp位点，该位点物理位置位于猪6号染色体的第93990293碱基处。本发明旨在发掘并鉴定与猪产肉性状相关的snp位点，进而为猪的遗传选育工作提供重要指导意义。
2、通过克隆猪6号染色体第93989710-93990481区段基因序列，并运用直接测序法寻找snp位点以及基因分型的方法，分析其与猪产肉性状的关联性，从而为猪的产肉性状建立新的标记辅助选择位点，提高猪肌肉产量。
3、本发明通过以下技术方案实现：
4、本发明获得了猪6号染色体第93989710-93990481区段基因序列，片段长度为771bp，其核苷酸序列见附图序列表seq id no.1所述，通过在ncbi网站进行blast比对，发现该扩增片段内存在一处核苷酸多态性(snp)位点，具体如图2所示。该snp位点的突变具体在6号染色体第93990293碱基处，碱基由c变为t。根据ensembl数据库的命名规则，将该突变位点命名为rs325716427。
5、试验材料选择包括法系大白、美系大白猪。从这些猪的血液中提取全基因组dna，并根据ncbi数据库公布的猪基因序列(nc_010448.4)设计引物对。引物对的序列如下：
6、正向引物(seq id no.2)：5’-ggtcaacagccttcagaa-3’，
7、反向引物(seq id no.3)：5’-gcatcctacatacagaatagc-3’。
8、上述引物对可对猪6号染色体第93989710-93990481区段基因区域的snp位点进行检测分型。
9、通过上述引物对进行pcr扩增、pcr产物的纯化、克隆测序和序列比对分析后，筛选得到1个与猪产肉性状关联的遗传标记。该遗传标记的核苷酸序列如下所示，其中突变位点位于序列的第585位，具体序列如下seq id no.1所示：
10、ggtcaacagccttcagaaaggaaggggttatgactgaataaggaaggtgctggaccaaaggcagagttggaggggctggtctctggttttactcacaaagagccaatattccctgagtttttactttgcaccagactctaagtactttgcatatattaatgcacttgattatccatcaactttgtgaaatatgtatttttatccttattttgaggatgagaacatggagacacagagaaagtaagtagctgccaagggtgatacagctaataatagcaaagcctggattcaaatccagacaatcaaatgtcaaggctccttatgctaaaaaaagtgcttcatctttaggctctagagcctctgtagtcagttaacctcttaaagcctcagtctctcatctgctaagagtggtggactcccgggagttcccttcgtggctcagtggttaacgaaccctactaggatccattagaatgcgggttcaatacctggccttgctcagtaggttaaggatccggcattgccgcattgccgtgagctgtggtgtaggttgcagacagggctcagatcctgcattgctgtggr(c/t)tgtggcgtaggccagcagttgcagctccccctagcct gggaacctccatatgcctcgagtgcggccctaaaaagcaaaaaagcaaaaaaaaagaaaaagcaaaaaaagggggtggactccctggcacacagcatttttatgaggatcagatgaaagcacagagaggctattctgtatgtaggatgc
11、本发明提供了一种筛选猪产肉性状相关联的遗传标记方法，所述的方法包括以下步骤：
12、从法系大白、美系大白猪的血液中提取基因组dna。根据fhl3转录起始位点上游+1142到上游+1913bp基因组序列设计引物。利用上述引物对猪基因组dna进行pcr扩增，并通过直接测序法获得该fhl3转录起始位点上游+1142到上游+1913的核苷酸序列(序列详见seq id no.1)，该序列中包含1个snp位点。利用该突变位点可作为遗传标记对法系大白、美系大白猪的产肉性状及肉品质性状进行关联分析。
13、本发明提供了一种用于检测上述序列中snp位点的基因型分型方法。
14、本发明进一步提供了利用直接测序法确定不同基因型个体与产肉性状和肉品质之间关联分析的应用，包括如下步骤：
15、为了确定猪6号染色体93989710-93990481区域内的snp与猪表型差异的相关性，选择美系大白和法系大白作为试验材料；通过直接测序法进行多态性检测，并分析多态性位点与猪产肉效率的相关性。采用sas统计软件中混合线性模型(mixed)对基因型与表型值之间的关联进行分析。
16、更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。
17、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
18、通过实验发现，多态性位点rs325716427在法系大白猪中与初生重、眼肌面积和达100kg日龄性状均具有显著相关性(p<0.05)。其中，cc基因型个体的初生重和眼肌面积均显著高于tt基因型个体(p<0.05)；在达100kg体重日龄性状方面，cc基因型个体达到100kg体重的日龄显著短于tt基因型个体(p<0.05)。在美系大白猪中cc基因型个体的眼肌面积显著大于tt基因型个体(p<0.05)；在活体背膘厚性状方面，cc基因型个体显著低于tt基因型个体(p<0.05)。从遗传稳定性和遗传进展方面来看，cc基因型在降低活体背膘厚、缩短达100kg体重日龄、增加初生重和眼肌面积性状方面具有明显优势。本发明旨在发掘并鉴定与猪产肉性状相关的snp位点，进而为猪的遗传选育工作提供重要指导。
1.一种与猪产肉性状相关的fhl3基因启动子snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记包括如seq id no.1所示的核苷酸序列，位于fhl3转录起始位点上游，其中，snp位点的突变具体在6号染色体第93990293碱基处，碱基由c变为t。
2.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，所述猪包括美系大白猪、法系大白猪。
3.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，用于检测snp分子标记的引物对序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
4.根据权利要求1所述的snp分子标记在提高猪产肉效率改善中的应用，其特征在于，在法系大白猪中与初生重、眼肌面积和达100kg日龄性状均具有显著相关性；其中，cc基因型个体的初生重和眼肌面积均显著高于tt基因型个体；在达100kg体重日龄性状方面，cc基因型个体达到100kg体重的日龄显著短于tt基因型个体；在美系大白猪中cc基因型个体的眼肌面积显著大于tt基因型个体；在活体背膘厚性状方面，cc基因型个体显著低于tt基因型个体。
