本发明涉及基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种基于perv逆转录酶的先导编辑系统，以及通过该系统进行基因编辑的方法。
背景技术：
0、发明背景
1、先导编辑(prime editing，pe)是近年来问世的新型基因编辑技术，可在不产生dna双链断裂的前提下实现点突变、插入、删除、替换等多种类型的编辑，克服了当前crispr/cas9和单碱基编辑技术的主要不足，是当前最为精准的基因组编辑技术。pe编辑系统由pe编辑器和先导编辑向导rna(pegrna和/或ngrna)组成。其中，pe编辑器是先导编辑的最重要组成部分，pe编辑器由cas9单切口酶(ncas9 h840a)与逆转录酶(rt)融合而成。当前效率较高且运用较为广泛的pe2及其改进版pemax编辑器，使用的是携带d200n、l603w、t330p、t306k、w313f五个突变的鼠莫洛尼氏鼠白血病病毒的逆转录酶(mmlv-rt)。
2、有团队使用其他类型的rt用于先导编辑，但其效率低于或显著低于pe2。另有报导表明，核衣壳蛋白(nc)与rt融合后有助于提高先导编辑效率，将mmlv的核衣壳蛋白(nc)与删除rnase h结构的mmlv-rt(mmlv-rt(δrnase h))融合，开发出效率增强型pe编辑器：eppe。但迄今为止的报道表明，eppe仅在植物细胞中显著提高编辑效率，在哺乳动物细胞中并未显著提高编辑效率。
3、本领域仍需要高效的先导编辑系统，特别是能够在哺乳动物细胞中进行高效编辑的先导编辑系统。
技术实现思路
0、发明简述
1、本发明使用perv-nc融合rnase h结构删除并携带多个突变位点的perv-rt替代pe2编辑器中的mmlv-rt，以提高先导编辑在哺乳动物中的效率。
1.一种用于靶向性修饰生物体基因组dna序列的先导编辑系统，其包含：
2.权利要求1的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶来自a型、b型或c型perv，或来自不同型perv的重组体，例如a/c型perv重组体。
3.权利要求1或2的先导编辑系统，其中所述perv是分离自巴马香猪的perv。
4.权利要求1-3中任一项的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶或其功能性变体包含seq id no:1-5之一的氨基酸序列或者与seq id no:1-5之一具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列相同性的氨基酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体缺失rnase h结构域。
6.权利要求1-5中任一项的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在选自第63位、199位、222位、305位、312位、329位、330位、331位、332位、408位或602位的一或多个位置处包含氨基酸取代。
7.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第199位、305位和312位处包含氨基酸取代。
8.权利要求7的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代d199n、t305k和w312f。
9.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第199位、305位、312位和602位处包含氨基酸取代。
10.权利要求9的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代d199n、t305k、w312f和l602w。
11.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第199位、305位、312位、329位、330位、331位和332位处包含氨基酸取代。
12.权利要求11的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代d199n、t305k、w312f、e329p、k330g、g331t和e332c。
13.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第199位、305位、312位、329位、330位、331位、332和602位处包含氨基酸取代。
14.权利要求13的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代d199n、t305k、w312f、e329p、k330g、g331t、e332c和l602w。
15.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第199位、222位、305位、312位和602位处包含氨基酸取代。
16.权利要求15的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代d199n、v222a、t305k、w312f和l602w。
17.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第63位、199位、222位、305位、312位和602位处包含氨基酸取代。
18.权利要求17的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代y63r、d199n、v222a、t305k、w312f和l602w。
19.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第199位、222位、305位、312位、408位和602位处包含氨基酸取代。
20.权利要求19的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代d199n、v222a、t305k、w312f、c408r和l602w。
21.权利要求6的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体在第63位、199位、222位、305位、312位、408位和602位处包含氨基酸取代。
22.权利要求13的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含氨基酸取代y63r、d199n、v222a、t305k、w312f、c408r和l602w。
23.权利要求1-4中任一项的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶的功能性变体包含seq id no:6-17或40-44之一的氨基酸序列。
24.权利要求1-23中任一项的先导编辑系统，其中在所述融合蛋白中，所述逆转录酶或其功能性变体在n端或c端与核衣壳蛋白(nc)直接地或通过接头融合。
25.权利要求24的先导编辑系统，其中所述核衣壳蛋白(nc)来自perv，优选地，所述核衣壳蛋白与所述逆转录酶来自相同类型的perv。
26.权利要求24或25的先导编辑系统，其中所述核衣壳蛋白包含seq id no:19或36-39之一所示氨基酸序列。
27.权利要求24-26中任一项的先导编辑系统，其中所述perv逆转录酶或其功能性变体在n端与核衣壳蛋白(nc)直接地或通过接头融合。
28.权利要求1-27中任一项的先导编辑系统，其中先导编辑融合蛋白中的所述crispr核酸酶如crispr切口酶和所述perv逆转录酶或其功能性变体通过接头相连。
29.权利要求1-28中任一项的先导编辑系统，其中所述crispr切口酶是cas9切口酶，例如，所述cas9切口酶包含seq id no:18所示氨基酸序列。
30.权利要求1-29中任一项的先导编辑系统，其中融合蛋白中的所述crispr核酸酶如crispr切口酶位于所述逆转录酶或其功能性变体的n端。
31.权利要求1-30中任一项的先导编辑系统，其中所述融合蛋白还可以包含核定位序列(nls)。
32.权利要求1-31中任一项的先导编辑系统，其中所述融合蛋白还可以包括直接或通过自裂解肽连接的可选择标记蛋白。
33.权利要求32的先导编辑系统，其中所述自裂解肽是2a多肽，所述可选择标记蛋白是puro-r蛋白。
34.权利要求1的先导编辑系统，其中所述融合蛋白包含seq id no:22-34或seq idno:45-49之一所示的氨基酸序列。
35.权利要求1-34中任一项的先导编辑系统，其中所述至少一种pegrna能够与所述融合蛋白形成复合物并将所述融合蛋白靶向基因组中的靶序列，导致所述靶序列内的切口。
36.权利要求1-35中任一项的先导编辑系统，其中至少一种pegrna中的先导序列被设置为与靶序列具有充分的序列相同性，优选100％相同性，从而能够通过碱基配对与靶序列的互补链结合，实现序列特异性靶向。
37.权利要求1-36中任一项的先导编辑系统，其中所述支架序列示于seq id no:21。
38.权利要求1-37中任一项的先导编辑系统，其中所述引物结合序列被设置为与所述靶序列的至少一部分互补，优选地，所述引物结合序列与所述切口导致的3’游离单链的至少一部分互补，特别是与所述3’游离单链的3’末端的核苷酸序列互补。
39.权利要求1-38中任一项的先导编辑系统，其中，所述rt模板序列被设置为对应于切口下游的序列，并包含期望的修饰，所述修饰包括一或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加。
40.权利要求1-39中任一项的先导编辑系统，其还包括切口grna和/或含有编码所述切口grna的核苷酸序列的表达构建体，所述切口grna包含先导序列和支架序列，所示先导序列被设置为与基因组中的靶序列具有充分序列相同性，从而能够将所述融合蛋白靶向所述靶序列，并导致所述靶序列内的切口，所述切口grna的靶序列与所述pegrna的靶序列位于基因组dna的相对链上，所述切口grna诱导的切口和所述pegrna诱导的切口相距大约1个-大约300个核苷酸。
41.权利要求1-40中任一项的先导编辑系统，其包含至少一对pegrna和/或含有编码所述至少一对pegrna的核苷酸序列的表达构建体。
42.权利要求41的先导编辑系统，所述pegrna对中的两种pegrna被设置为靶向基因组dna的相同链上的不同靶序列，或者，所述pegrna对中的两种pegrna被设置为靶向基因组dna的不同链上的靶序列。
43.权利要求41-42中任一项的先导编辑系统，所述pegrna对中的两种pegrna被设置为导入相同的期望的修饰。
44.权利要求1-43中任一项的先导编辑系统，所述pegrna在3’端包含seq id no:51所示的截短的csy4识别序列。
45.一种产生经遗传修饰的细胞的方法，包括将要求1-44中任一项的先导编辑系统导入至少一个所述细胞，由此导致所述至少一个细胞的基因组序列的修饰。
46.权利要求45的方法，其中所述先导编辑系统在选自rs-1、诺考达唑(nocodazole)和曲古抑菌素a(trichostatin a(tsa))的一或多种小分子化合物(优选rs-1和诺考达唑)的存在下导入所述细胞；或者
47.权利要求45或46的方法，其中所述细胞来自哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫。
