本发明涉及检测dna分子中胞嘧啶碱基甲基化状态的方法，尤其是利用双链dna脱氨酶使得未甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶的方法。本发明还涉及检测检测dna分子中胞嘧啶碱基甲基化状态的试剂盒，其包括双链dna脱氨酶。
背景技术：
1、dna甲基化(dna methylation)是生物体内在dna上发生甲基化化学修饰的现象，其化学本质是：在胞嘧啶碱基的嘧啶环第5位碳原子上，原有的一个氢原子被替换成甲基，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)。这种dna修饰在不改变dna序列的前提下，影响了基因表达与调控、细胞分裂与分化、细胞的代谢与生长等诸多生命过程，最终影响着生物个体的生长发育、代谢繁衍、疾病发生发展和衰老死亡，是一种表观遗传因子，在表观遗传调控方面发挥重要作用。因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶碱基配对方式相同，所以如果需要对dna序列上甲基化修饰进行高通量测序(next generation sequencing,ngs)，必须先特异性地将具有/不具有甲基化的胞嘧啶转化为其他碱基，才能区分甲基化修饰。
2、当前广泛使用的dna甲基化检测方法为重亚硫酸盐转化法(bisulfiteconversion)，其通过重亚硫酸盐实现未甲基化的胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶碱基。该方法需要将包含dna分子或dna片段的样品在严酷环境下(如高温、高盐、酸性环境)反应数个小时，会使得dna变性、断裂，大部分dna会在转化反应过程中降解丢失。因此，其缺点至少包括：这个方法的操作过程时间很长，并且要经历相对比较高的温度，对于dna本身的质量破坏明显；这个化学处理的过程会对dna模版造成大量的损耗，通常认为处理后的dna模版只有原来的1/10不到。这对含量较低的样本来说是致命的，例如古生物/化石中的dna，或者临床样本中的例如血液的cfdna。
3、近年来基于酶学转化法的dna甲基化测序技术逐渐发展成熟，例如em-seq技术，其借助单链dna脱氨酶apobec3a进行胞嘧啶碱基向尿嘧啶碱基的转化。酶学转化法摒弃了严酷的化学处理过程，避免在转化时对dna造成断裂和降解，但依然存在一些问题，例如，就em-seq技术来说，因为apobec3a仅能对单链dna进行转化，需要对dna进行打断并使用甲酰胺或氢氧化钠对dna进行处理，保证dna双链完全变为单链状态，但实际操作中无法保证所有双链dna分子的所有区域均能变成单链dna，因而有些区域无法完成充分的apobec3a介导的转化；脱氨酶apobec3a在胞嘧啶碱基c前面一位有明显的碱基偏好性，对于大部分位点可能存在转变不足的情况。因此，本领域仍亟需开发新的甲基化检测方法。
技术实现思路
1、在一方面，本文提供了检测dna分子中胞嘧啶碱基甲基化状态的方法，包括如下步骤：
2、1)让所述dna分子与氧化试剂接触，使得所述dna分子中的甲基化胞嘧啶碱基被氧化；
3、2)用双链dna脱氨酶处理所述dna分子，使得所述dna分子中非甲基化胞嘧啶碱基发生脱氨基反应；以及
4、3)将所述dna分子中未发生脱氨基反应的胞嘧啶碱基鉴定为甲基化胞嘧啶碱基，发生了脱氨基反应的胞嘧啶碱基鉴定为未甲基化胞嘧啶碱基。
5、在一些实施方案中，所述双链dna脱氨酶选自：
6、1)野生型ddd_ss或其突变体；
7、2)野生型ddd_fa或其突变体；以及
8、3)野生型ddd_bc或其突变体。
9、在一些实施方案中，所述突变体与其对应野生型双链dna脱氨酶在氨基酸序列上有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
10、在一些实施方案中，所述双链dna脱氨酶为野生型ddd_ss或野生型ddd_fa。
11、在一些实施方案中，步骤1)中甲基化胞嘧啶碱基被氧化为5fc、5cac和/或5gmc。
12、在一些实施方案中，所述氧化试剂包括tet蛋白，或tet蛋白和糖基转移酶，例如t4噬菌体β-葡糖基转移酶(t4-bgt)。
13、在一些实施方案中，步骤2)不包括对所述dna分子进行变性处理。
14、在一些实施方案中，步骤3)通过测序来鉴定所述dna分子中的胞嘧啶碱基是否为甲基化胞嘧啶碱基，优选地，所述测序选自sanger测序、二代测序(ngs)和三代测序(单分子测序)。
15、在一些实施方案中，步骤3)通过扩增来鉴定鉴定所述dna分子中的胞嘧啶碱基是否为甲基化胞嘧啶碱基，优选地，所述扩增通过甲基化特异性pcr进行。
16、另一方面，本文提供了检测dna分子中胞嘧啶碱基甲基化状态的试剂盒，包括
17、1)氧化试剂，所述氧化试剂能够使得所述dna分子中的甲基化胞嘧啶碱基被氧化；和
18、2)双链dna脱氨酶。
19、在一些实施方案中，所述氧化试剂包括tet蛋白，或tet蛋白和糖基转移酶，例如t4噬菌体β-葡糖基转移酶(t4-bgt)。
20、在一些实施方案中，所述双链dna脱氨酶选自：
21、1)ddd_ss或其突变体；
22、2)ddd_fa或其突变体；以及
23、3)ddd_bc或其突变体。
24、在一些实施方案中，所述突变体与其对应野生型双链dna脱氨酶在氨基酸序列上有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
25、在一些实施方案中，所述双链dna脱氨酶为野生型ddd_ss或野生型ddd_fa。
26、本文提供的方法采用双链dna脱氨酶对dna进行脱氨基处理，无需双链变性步骤，对dna样本损耗极低，降低了对胞嘧啶附近碱基的偏好性，简化了操作流程，提高了检测准确度。
1.检测dna分子中胞嘧啶碱基甲基化状态的方法，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述双链dna脱氨酶选自：
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述突变体与其对应野生型双链dna脱氨酶在氨基酸序列上有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述双链dna脱氨酶为野生型ddd_ss或野生型ddd_fa。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤1)中甲基化胞嘧啶碱基被氧化为5fc、5cac和/或5gmc。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述氧化试剂包括tet蛋白，或tet蛋白和糖基转移酶，例如t4噬菌体β-葡糖基转移酶(t4-bgt)。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中步骤2)不包括对所述dna分子进行变性处理。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤3)通过测序来鉴定所述dna分子中的胞嘧啶碱基是否为甲基化胞嘧啶碱基，优选地，所述测序选自sanger测序、第二代测序(ngs)和第三代测序(单分子测序)。
9.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤3)通过扩增来鉴定鉴定所述dna分子中的胞嘧啶碱基是否为甲基化胞嘧啶碱基，优选地，所述扩增通过甲基化特异性pcr进行。
10.检测dna分子中胞嘧啶碱基甲基化状态的试剂盒，包括
11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述氧化试剂包括tet蛋白，或tet蛋白和糖基转移酶，例如t4噬菌体β-葡糖基转移酶(t4-bgt)。
12.如权利要求10或11所述的试剂盒，其中所述双链dna脱氨酶选自：
13.如权利要求10-12任一项所述的试剂盒，其中所述突变体与其对应野生型双链dna脱氨酶在氨基酸序列上有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。
14.如权利要求10-13任一项所述的试剂盒，其中所述双链dna脱氨酶为野生型ddd ss或野生型ddd fa。
