信号转导与转录活化因子3的非肽类抑制剂在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用

1.本发明涉及医药用途领域，具体是信号转导与转录活化因子3的非肽类抑制剂在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用。


背景技术：

2.草鱼一直居于我国水产养殖品种之首，由草鱼呼肠孤病毒(gcrv)引起的草鱼出血病每年都给草鱼养殖业带来巨大的经济损失，该疾病具有严格的温度依赖性，发病周期明显，一般在春秋季节，水温在25℃时发病，目前还没有针对该疾病的药物上市。
3.草鱼呼肠孤病毒(gcrv)与正呼肠孤病毒具有相似的形态结构特征，是二十面体的双链rna病毒，直径约70nm，病毒核心直径约50nm，无囊膜，最外层为7种衣壳蛋白(vp1-vp7)，负责病毒侵染，其中，构成病毒外衣壳的vp5和vp7蛋白可能与病毒感染宿主通过细胞膜有关。该病毒具有11条基因片段，每条片段均包含一个开放阅读框，s1和m3片段分别编码病毒外衣壳不同的多肽，l1、l2、l3、m4、m5和s10分别编码病毒的核心衣壳。
4.因此，亟需一种药物来抑制草鱼呼肠孤病毒，来确保草鱼的养殖产量。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供信号转导与转录活化因子3的非肽类抑制剂在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.信号转导与转录活化因子3的非肽类抑制剂在制备抗草鱼呼肠孤病毒药物中的应用，信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic主要抑制il6-stat3通路，进而抑制gcrv感染草鱼细胞的入胞阶段及gcrv后期在细胞内的扩增。
8.作为本发明进一步的方案：信号转导与转录活化因子3(stat3)与包括炎症因子在内的各类细胞因子转录活化相关。
9.作为本发明进一步的方案：信号转导与转录活化因子3(stat3)结构与其他stat家族成员相似，包括6个结构区域，即n末端结构域(nd)、coil-coil结构域(ccd)、dna结合域(dbd)、连接域(linker)、sh2结构域和c末端转录激活结构域(tad)，其核心片段包括ccd、dbd、linker、而sh2结构域为单体，磷酸化后激活stat3，变为二聚体，未磷酸化的stat3以单体的形式存在。
10.作为本发明进一步的方案：信号转导与转录活化因子3(stat3)在病毒感染中根据不同病毒种类存在不同表型，病毒所携带的各种病毒蛋白能激活或抑制stat3的磷酸化，从而正向或负向调控stat3的活性，stat3在适应性免疫应答中也发挥重要作用，特别是在调节t淋巴细胞功能方面，stat3通过阻止细胞凋亡介导il-6依赖的t细胞增殖。
11.作为本发明进一步的方案：信号转导与转录活化因子3(stat3)也参与调节cd4 和cd8 t的增殖和分化，并且stat3在上调cd8 t细胞介导的病毒应答中是必不可少的，在单纯
疱疹病毒(hsv-1)感染宿主时，stat3在激活cd8 t细胞有效应答病源感染中发挥重要作用，stat3在病毒和宿主之间的复杂相互作用中发挥着重要作用，根据涉及的病毒和宿主细胞类型，stat3可以作为促进或抵抗病毒感染的因子。
12.作为本发明再进一步的方案：信号转导与转录活化因子3(stat3)调节抗病毒和促炎反应，通过其他细胞因子的转录调控，或者通过与其作为转录因子无关的某些途径，影响到病毒侵染宿主或在宿主体内复制增殖过程。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
14.本发明揭示了stattic的一种新的生物学功能，能有效抑制gcrv病毒入胞以及其在胞内复制，从而阻断该病毒感染草鱼细胞，本发明还发现在一定浓度下，stattic对草鱼细胞没有毒性，为研制抗gcrv病毒药物提供了理论和事实依据。
附图说明
15.图1为信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic对gcrv感染草鱼肾上皮细胞系(cik)的抑制作用图。
16.图2为信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic和激活剂对gcrv感染草鱼性腺细胞(gco)和肾上皮细胞系(cik)时入胞的影响图。
17.图3为gcrv外衣壳蛋白vp7、vp5与stat3的相互作用图。
18.图4为信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic对草鱼细胞无毒害的作用图。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic在细胞和分子水平上都能对gcrv感染草鱼细胞系有抑制作用，暗示stattic可以做为潜在的抗草鱼出血病病毒药物而进一步研究开发。首先从正反两方面验证：il6-stat3通路激活剂预处理草鱼性腺细胞和草鱼肾细胞后能促进gcrv入胞，用stat3抑制剂stattic处理草鱼肾细胞后能抑制gcrv入胞，并抑制其在胞内复制。其次，本发明证明了gcrv的外衣壳蛋白能促使stat3磷酸化，从而激活stat3，使其从细胞质中转移到细胞膜结构上发挥作用。
21.实验一
22.信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic对gcrv感染草鱼肾上皮细胞系(cik)的抑制作用。
23.实验材料
24.1、细胞、病毒毒株
25.草鱼肾细胞系(cik)、草鱼性腺细胞系(gco)由本实验室保存、gcrv毒株由本实验室保存。
26.2、试剂及试剂盒
27.m199培养基及胎牛血清(gibco)、stat3和stat3p抗体、stattic(mce)。
28.rna提取、逆转录酶、荧光定量
29.rna提取试剂盒、逆转录试剂盒、sybr green pcr master mix。
30.仪器耗材
31.细胞培养皿、细胞培养板、细胞培养瓶、离心机、二氧化碳培养箱、细胞操作台、纯水系统、荧光定量pcr系统。
32.实验方法
33.1、细胞复苏及传代培养
34.1)从液氮中取出cik或gco细胞，37℃水浴迅速融化；
35.2)用75％洒精消毒冻存管，置于消杀过的生物安全柜中；
36.3)用移液管吸取5ml含10％血清的m199培养基到t25细胞培养瓶中，再用吸管将融化的细胞液转移至培养瓶，并轻轻吹找一遍，再置于28℃细胞培养箱中，5％二氧化碳，静置培养8小时左右；
37.4)待细胞贴壁后，更换新的培养基，以除去细胞冻存液中的dmso；
38.5)待细胞铺满细胞培养瓶后，用吸管吸取培养基并弃去；
39.6)向培养瓶中加入10ml无菌pbs，轻晃细胞瓶，清洗细胞一次，并弃去；
40.7)向细胞瓶中加入1ml胰酶，消化细胞2分钟左右，使细胞从贴壁状态变为脱落状态(消化后期可轻轻拍打细胞瓶，辅助细胞脱落)；
41.8)向细胞瓶中再加入9ml细胞培养基，轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞(显微镜观察)并中和消化后的胰酶。
42.9)把上述10ml细胞悬浮液分装到两个t25细胞瓶中，静置于27℃、5％二氧化碳细胞培养箱中培养。
43.2、gcrv感染cik或gco细胞
44.将培养好的细胞换成无血清的基础培养基m199，加入gcrv，剂量约为10moi，分别于1小时、3小时和6小时收集细胞，1小时细胞样用于测病毒入胞效率，3小时和6小时细胞样用于测病毒在细胞内增殖效率。
45.3、反转录及荧光定量检测目的基因mrna表达水平
46.1)反转录反应体系
47.rna 2.0μg
48.random primer 0.5μl
49.oligo dt primer 0.5μl
[0050]5×
reaction buffer 4μl
[0051]
dntp mix 2μl
[0052]
rnase inhibitor 1μl
[0053]
revert aid m-mu lvrt 1μl
[0054]
反转录反应条件：前三组分，65℃、5min；加入后四个组分后25℃、5min，42℃、70min，70℃、5min。
[0055]
2)rt-pcr引物反应体系
[0056]
①
目的基因的检测引物和内参引物
stat3通路的另一种抑制剂孵育cik细胞，处理方式同图a图b，从图中可知，gcrv的入胞和复制效率都被抑制，但抑制效率小于stattic处理组。图2e、f从反面证明il6-stat3通路对gcrv感染cik细胞时病毒入胞的影响，用il6-stat3通路激活剂孵育正常培养的cik细胞，感染gcrv后1小时取样测病毒入胞效率，从图中可知，il6和peg2都能激活gcrv的入胞。综上所述，il6-stat3通路能够影响gcrv感染宿主细胞，且该通路的激活与否和gcrv的感染呈正相关关系，抑制剂stattic和bazedocifene都能够抑制该通路活性，从而抑制gcrv感染cik细胞，但stattic的抑制效果更优。
[0083]
实验三
[0084]
stat3与病毒衣壳蛋白的互作。
[0085]
实验材料
[0086]
公用材料同实验一，凝胶成像系统、电泳及转膜系统、western扫描系统、ni-bead、wb及ip细胞裂解液、pegfp-his-vp7-beads、pegfp-his-vp5-beads、pegfp-his-vector-beads由本实验室自制。
[0087]
实验方法
[0088]
pull-dwon及western检测蛋白互作(9cm细胞培养皿)
[0089]
1)蛋白制样及pull-dwon
[0090]
贴壁细胞弃培养基后用预冷的pbs洗涤一次，用细胞刮刮动细胞生长面，加入1ml含pmsf的细胞裂解液，收集细胞后至1.5ml ep管中，冰上裂解10分钟，中间振荡三次。4℃，12000rpm离心10min，将上清转移至新的ep管中，取出100ul做为wcl，保存于-80度。向剩余的上清液中加入30ul重化的pegfp-his-vp7-beads(pegfp-his-vp5-beads)，对照加入等量pegfp-his-vector-beads。4℃反转振荡孵育过8-12小时，2000rpm离心1分钟，弃上清，留沉淀beads，用裂解液洗涤beads三次，加50μl pbs，再加入5
×
loading buffer，沸水煮样品5分钟，待下一步实验或保存到-20℃。
[0091]
2)western-blot检测
[0092]
4％-12％的sds-page胶上样，mops缓冲液系统电泳分离蛋白，80v浓缩，120v分离，以10-180kd范围预染标准蛋白marker为指示；将page胶从玻璃板中取下，浸入转膜缓冲液，同时将同样大小的pvdf膜经活化液活化后也置于转膜缓冲液；按黑板-海绵-滤纸-page胶-pvdf膜-滤纸-海绵-白板的“三明治”结构放入转膜槽，负极对胶面，正极对pvdf膜面，置于转膜系统中，放转膜系统于泡沫盒中，在转膜系统与泡沫盒空隙中加入冰，用以冷却转膜过程中产生的热量；200ma，转膜100分钟，小心取出膜后用5％的脱脂奶粉(tbst配制)室温封闭1-2h，tbst洗涤5min后，弃tbst，加入按说明书用tbst稀释的一抗，4℃孵育过夜，摇床洗膜3次，每次10分钟，用pbs根据说明书稀释二抗后加入膜中，室温孵育1小时，摇床洗膜3次，每次10分钟，用滤纸吸去膜上的洗膜缓冲液，在暗室按比例加入曝光底物，用western扫描系统采集信号分析。
[0093]
实验结果与讨论
[0094]
如图3a所示，用gcrv感染cik细胞后2小时，提cik细胞裂解液总蛋白，用rabbit-anti-stat3抗体做一抗进行wb检测，从图中可以看出，感染gcrv后，cik细胞中stat3本底表达量和激活后磷酸化的stat3p本底表达量明显增强，此结论说明gcrv感染cik细胞能诱导stat3的表达或增强其活化程度(磷酸化的stat3表达量)。图3b所示，用纯化的gcrv病毒衣
壳蛋白vp5、vp7通过pull-down技术检测其与stat3的相互作用，从图中可知，阴性对照vec和空beads组的泳道基本没有条带，vp7和vp5泳道处有明显条带。说明vp7、vp5明显能把stat3蛋白从细胞裂解液中拉下来，暗示gcrv外衣壳蛋白vp7和vp5能与stat3蛋白互作。图3c中，我们用vp7和vp5蛋白分别拉cik细胞的膜蛋白和质蛋白，从图中可知，stat3主要存在于细胞质中，当其被激活为stat3p时，其会从细胞质转移到细胞膜上，参与一系列的生化反应，且vp5和vp7都可以分别从cik的胞质、胞膜中拉下stat3和stat3p。
[0095]
实验四
[0096]
信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic对草鱼细胞无毒害作用。
[0097]
实验材料：同实验一
[0098]
实验方法：同实验一
[0099]
实验结果与讨论
[0100]
前面实验中我们用到stattic抑制剂，来验证其对gcrv感染草鱼的抑制作用，并证明其对gcrv的抑制作用具有浓度依赖性，在一定范围内抑制剂浓度与对gcrv的抑制能力正相关，但没有验证抑制剂本身是否对细胞有毒性，以及在我们的用量范围内，对细胞毒性的大小。如图4所示，我们用不同浓度的stattic分别处理cik细胞和gco细胞4小时，再用台盼蓝测细胞存活率，从图中可以看出在1μm浓度范围内，stattic对细胞存活率基本没有影响。为后续stattic做为草鱼出血病预防或治疗的潜在药物提供理论及实践指导。
[0101]
综合以上四个实验，我们可以得出gcrv感染草鱼细胞可以被信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic高效抑制，并揭示了尚未被发现的信号转导与转录活化因子3(stat3)的非肽类抑制剂stattic的新生物学功能，为后续研究由gcrv引起的草鱼出血病药物提供理论和事实基础。
[0102]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0103]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。