本发明涉及一种工程化的具有肿瘤杀伤能力的细胞，尤其涉及一种表达trail和il24的ipscs及其衍生细胞、包含所述细胞的药物组合物及其应用。
背景技术：
1、肿瘤是危害人类身体健康的常见疾病之一，在国内外，肿瘤的发病率和死亡率都在逐步提升。从原理上讲，肿瘤是一种复杂的进行性疾病，涉及的失调通路较多，要达到精准的靶向治疗效果，在实际的临床治疗方案中往往需要多种手段并用。在肿瘤治疗方案中，除了传统的放化疗之外，肿瘤免疫治疗也取得了较好的实验效果，同时基于全基因测序的精准医疗、肿瘤免疫疗法以及基因治疗等均属于本领域技术人员所关注的可行性方向。
2、实践证明，细胞因子在肿瘤治疗过程中发挥了重要的作用。例如，现有技术一方面公开了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)可选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞，是一种极具潜力的治疗分子。但是在实践过程中发现存在多种肿瘤细胞或细胞亚群对trail不敏感，某些肿瘤细胞具有抵抗trail攻击的能力，而且在治疗后期容易出现耐药现象，无法达到期望的治疗效果。
3、il24，即白细胞介素24，又称黑色素瘤分化相关基因，il24能够抑制肿瘤细胞的转移和生长，促进肿瘤细胞凋亡，但il24对正常细胞本身没有影响，因此可被用于肿瘤细胞的治疗。
4、ipscs技术的出现在基因治疗领域具有里程碑式的意义，不仅规避了伦理方面的争议，还由于患者自体细胞的来源，为基因治疗提供了良好的基础。ipscs具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，可作为基因打靶时的靶细胞。现有技术中另外还公开了将具有肿瘤抑制作用的细胞因子靶入ipscs中进行肿瘤治疗的相关技术方案。结果证明，虽然ipscs经过基因打靶的改进，相应的肿瘤抑制细胞因子表达量得到了提升，但仍然无法达到令人满意的程度，难以大幅度提高ipscs及其衍生细胞的肿瘤杀伤性。
5、间充质干细胞(mscs)因其具有良好的增殖能力和多向分化潜能，在临床试验中得到了广泛的应用。另外，经过基因改造的工程化mscs也是一种良好的肿瘤治疗用的工具细胞。现有技术(“enhanced tumor growth inhibition by mesenchymal stemcellsderived from ipscswith targeted integration of interleukin24 into rdna loci”，bo liu et al.，oncotarget，第8卷第25期，第40791-40803页，2017年3月28日)，以及现有技术(“site-specific integration of trail in ipsc-derived mesenchymal stemcells for targeted cancer therapy”，zujia wang et al.，stemcells translationalmedicine，第11卷第3期，第297–309页，2022年3月10日)均公开了单基因靶入的ipscs及其衍生细胞，尤其是经ipscs分化的mscs。然而实验结果显示，单基因靶入的ipscs衍生的mscs肿瘤杀伤能力有限，且将不同单基因靶入的ipscs衍生的mscs组合使用进行肿瘤杀伤时，并未达到预期的效果，其肿瘤杀伤性能表现不佳。另外本领域研究人员经实验研究发现，与将trail和il24同时构建于质粒中直接进行肿瘤杀伤，或将trail和il24同时靶入病毒中进行肿瘤杀伤的技术方案相比，将trail和il24同时靶入工程化细胞(例如工程化的t细胞、nk细胞等)时，两种治疗因子在同一细胞中存在相互抑制的问题，并不能实现两种治疗因子的良好表达，无法实现增强的肿瘤杀伤性能，与预期的结果出现了较大的差异。
6、因此如何同时利用trail和il24来进一步提高工程化细胞的肿瘤杀伤能力，成为当前研究中亟需解决的技术问题之一。
技术实现思路
1、本发明的发明人经过大量实验，意外发现将trail和il24同时靶入工程化细胞(例如工程化的多能干细胞或其衍生细胞)时，显著提高了工程化细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
2、在第一个方面，本发明提供一种多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述诱导多能干细胞或其衍生细胞同时表达白介素24(il24)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)。
3、在本发明的一些实施方案中，所述trail的表达量和il24的表达量高于正常细胞中trail的表达量和/或il24的表达量。
4、在本发明的另一些实施方案中，所述多能干细胞选自诱导多能干细胞(ipscs)或间充质干细胞(mscs)，优选地，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。所述诱导多能干细胞的衍生细胞为所述诱导多能干细胞经诱导分化而来的细胞，优选地，所述诱导多能干细胞的衍生细胞为诱导多能干细胞分化而来的t细胞、nk细胞、b细胞、间充质干细胞、内皮细胞、肝细胞、心肌细胞或神经元细胞，更优选地，所述诱导多能干细胞的衍生细胞为诱导多能干细胞分化而来的间充质干细胞。
5、在本发明的一些实施方案中，所述il24是经修饰或未经修饰的il24，还包括具有il24功能的各种变体形式。
6、在本发明的另一些实施方案中，所述trail选自膜结合型trail或可溶型trail，优选地，所述trail为可溶型trail，更优选地，所述trail选自ilz-trail、flag-trail、his-trail、leucine zipper trail(iz-trail)、hsa-trail、peg-trail、tnc-trail、scfv:trail、trail的d269h突变体和s159r突变体，再优选地，所述trail为ilz-trail。
7、在本发明的又一些实施方案中，所述多能干细胞或其衍生细胞的基因组中整合有编码所述trail和il24的多核苷酸。
8、在本发明的一些实施方案中，所述多核苷酸定点整合在所述多能干细胞或其衍生细胞的基因组中。在本发明的另一些实施方案中，所述定点整合位点位于基因组的核糖体rna转录区(rdna区)，例如5s rrna、5.8s rrna、18s rrna或28s rrna的转录区，优选地，所述定点整合位点位于18s rrna的转录区，更优选地，所述定点整合位点位于18s rrna转录区的5468位点。
9、在第二个方面，本发明提供一种构建如第一方面所述的多能干细胞或其衍生细胞的方法，包括在多能干细胞或其衍生细胞的基因组中整合编码trail和il24的多核苷酸，所述多能干细胞选自诱导多能干细胞(ipscs)或间充质干细胞(mscs)，优选地，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。所述诱导多能干细胞的衍生细胞为所述诱导多能干细胞经诱导分化而来的细胞，优选地，所述诱导多能干细胞的衍生细胞为诱导多能干细胞分化而来的t细胞、nk细胞、b细胞、间充质干细胞、内皮细胞、肝细胞、心肌细胞或神经元细胞，更优选地，所述诱导多能干细胞的衍生细胞为诱导多能干细胞分化而来的间充质干细胞。
10、在本发明的一些实施方案中，所述整合通过基因编辑进行，例如cre-lox系统、zinc finger nucleases(zfns)、crispr-cas9或transcription activator-likeeffector nucleases(talens)，优选为crispr-cas9或talens。
11、在本发明的另一些实施方案中，所述定点整合位点位于基因组的核糖体rna转录区(rdna区)，例如5s rrna、5.8s rrna、18s rrna或28s rrna的转录区，优选地，所述定点整合位点位于18s rrna的转录区，更优选地，所述定点整合位点位于18s rrna转录区的5468位点。
12、在本发明的又一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
13、1)将所述编码trail和il24的多核苷酸插入靶向所述核糖体rna转录区的载体，优选为mini-phrneo载体；
14、2)将步骤1)获得的载体导入多能干细胞或其衍生细胞；和
15、3)筛选步骤2)获得的多能干细胞或其衍生细胞，获得在所述核糖体rna转录区携带所述编码trail和il24的多核苷酸的稳定细胞株。
16、本发明中对trail和il24导入细胞的方式和时机没有特别地限制，只要能够使trail和il24安全有效地表达即可，包括但不限于同时导入或非同时导入的方式。在一些实施方案中，采用同时导入的方式。
17、本发明中对trail和il24在细胞中的整合方式没有特别地限制。整合可以是在基因组内任意安全位点进行整合，能够使治疗因子il24和trail蛋白同时安全有效地表达即可。整合后对宿主细胞正常功能影响小，并能保持稳定的转基因表达。在一些实施方案中，将表达trail和il24的基因整合于基因组的rdna区，以提高trail和il24在细胞中的表达水平。
18、在第三个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含第一个方面所述的多能干细胞或其衍生细胞或第二个方面所述的方法构建的多能干细胞或其衍生细胞，以及药学上可接受的载体。
19、在第四个方面，本发明提供第一个方面所述的多能干细胞或其衍生细胞、第二个方面所述的方法构建的多能干细胞或其衍生细胞或第三个方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。所述肿瘤选自晚期或难治性肝细胞癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、胃食管交界处腺癌、胆管癌、尿路上皮癌和食管方形细胞癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌、胶质母细胞瘤、结直肠腺癌、垂体瘤、垂体腺瘤、垂体大腺瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、绒癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤、上皮样滋养细胞肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、肺腺癌和胶质肉瘤。
20、在第五个方面，本发明提供一种治疗肿瘤的方法，包括向有此需要的受试者施用第一个方面所述的多能干细胞或其衍生细胞、第二个方面所述的方法构建的多能干细胞或其衍生细胞或第三个方面所述的药物组合物。所述肿瘤选自晚期或难治性肝细胞癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、胃食管交界处腺癌、胆管癌、尿路上皮癌和食管方形细胞癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌、胶质母细胞瘤、结直肠腺癌、垂体瘤、垂体腺瘤、垂体大腺瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、绒癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤、上皮样滋养细胞肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、肺腺癌和胶质肉瘤。
21、相对于现有技术而言，本发明具有至少以下一种优势：
22、本发明所公开的技术方案中整个工艺流程不涉及病毒，以ipscs或其衍生细胞为治疗因子的载体，降低了潜在免疫反应、以及脱靶和插入突变等风险。
23、在本发明的具体实施方式中，特别地将trail和il24靶入ipscs及其衍生细胞中，尤其是imscs中，克服了trail和il24被靶入其他工程化细胞(非ipscs来源的工程化细胞，如t细胞、nk细胞等)中时存在的表达相互抑制问题，在ipscs及其衍生细胞中实现了trail和il24同时良好的表达，促进了工程化细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。另外，在本发明的实施例所公开的技术方案中，特异性地将il24和trail靶入同一个ipscs细胞中，并诱导分化为il24-trail-imscs，促进了肿瘤细胞的凋亡，相对于单基因靶入，或者trail和il24分别靶入不同imscs组合使用时的技术方案，il24-trail-imscs表现出更优异的肿瘤杀伤能力。
24、本发明的技术方案中将il24和trail靶入同一细胞，在促进肿瘤细胞有效杀伤的同时，进一步降低了工程化细胞的使用量，减少了工程化细胞自身可能存在的风险。在本发明中，对靶入时机没有特别地限制，能够使trail和il24同时有效地持续表达即可，在本发明的具体实施方式中优选地，il24和trail采用同时靶入的方式，有利于实现il24和trail同时持续表达，进一步提高il24-trail-imscs的肿瘤杀伤能力。
25、本发明公开了一种非病毒的多基因整合的杀伤性ipscs及其衍生细胞，所述杀伤性ipscs及其衍生细胞被导入il24和trail基因，克服了il24和trail在其他工程化细胞中(非ipscs来源的工程化细胞，如t细胞、nk细胞等)存在的表达抑制问题，展现出了更强的肿瘤杀伤能力。由于机体的预存免疫会影响病毒载体疗效的发挥，加速对载体的清除，本发明所提供的杀伤性ipscs及其衍生细胞在制备过程中全程并未涉及病毒。且本发明实施例中以mscs为治疗因子的载体，mscs是一种已被广泛证明具有低免疫源性的细胞，在人体内具有较好的耐受性。本发明实施例中所公开的技术方案能够使用更少数量的mscs，发挥更大的肿瘤杀伤作用，这也进一步降低了工程化细胞自身所带来的潜在风险，为肿瘤治疗药物提供了一种更优的选择，拓宽了ipscs及其衍生细胞的应用范围和实际使用价值。
1.一种多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述多能干细胞或其衍生细胞同时表达白介素24(il24)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)。
2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述trail的表达量和il24的表达量高于正常细胞中trail的表达量和/或il24的表达量。
3.根据权利要求1或2所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述多能干细胞选自诱导多能干细胞(ipscs)或间充质干细胞(mscs)，优选地，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。
4.根据权利要求3所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述诱导多能干细胞的衍生细胞为所述诱导多能干细胞经诱导分化而来的细胞，优选地，所述诱导多能干细胞的衍生细胞为诱导多能干细胞分化而来的t细胞、nk细胞、b细胞、间充质干细胞、内皮细胞、肝细胞、心肌细胞或神经元细胞，更优选地，所述诱导多能干细胞的衍生细胞为诱导多能干细胞分化而来的间充质干细胞。
5.根据权利要求1至4任一所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述il24是经修饰或未经修饰的il24。
6.根据权利要求1至5任一所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述trail选自膜结合型trail或可溶型trail，优选地，所述trail为可溶型trail，更优选地，所述trail选自ilz-trail、flag-trail、his-trail、leucine zipper trail(iz-trail)、hsa-trail、peg-trail、tnc-trail、scfv:trail、trail的d269h突变体和s159r突变体，再优选地，所述trail为ilz-trail。
7.根据权利要求1至6任一所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述多能干细胞或其衍生细胞的基因组中整合有编码所述trail和il24的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述多核苷酸定点整合在所述多能干细胞或其衍生细胞的基因组中。
9.根据权利要求8所述的多能干细胞或其衍生细胞，其中，所述定点整合位点位于基因组的核糖体rna转录区(rdna区)，例如5s rrna、5.8s rrna、18s rrna或28s rrna的转录区，优选地，所述定点整合位点位于18s rrna的转录区，更优选地，所述定点整合位点位于18srrna转录区的5468位点。
10.一种构建权利要求1至9任一所述的多能干细胞或其衍生细胞的方法，包括在多能干细胞或其衍生细胞的基因组中整合编码trail和il24的多核苷酸，所述多能干细胞选自诱导多能干细胞(ipscs)或间充质干细胞(mscs)，优选地，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述il24是经修饰或未经修饰的il24。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述trail选自膜结合型trail或可溶型trail，优选地，所述trail为可溶型trail，更优选地，所述trail选自ilz-trail、flag-trail、his-trail、leucine zipper trail(iz-trail)、hsa-trail、peg-trail、tnc-trail、scfv:trail、trail的d269h突变体和s159r突变体，再优选地，所述trail为ilz-trail。
13.根据权利要求10至12任一所述的方法，其中，所述整合通过基因编辑进行，例如cre-lox系统、zinc finger nucleases(zfns)、crispr-cas9或transcription activator-like effector nucleases(talens)，优选为crispr-cas9或talens。
14.根据权利要求10至13任一所述的方法，其中，所述定点整合位点位于基因组的核糖体rna转录区(rdna区)，例如5s rrna、5.8s rrna、18s rrna或28s rrna的转录区，优选地，所述定点整合位点位于18s rrna的转录区，更优选地，所述定点整合位点位于18s rrna转录区的5468位点。
15.根据权利要求10至14任一所述的方法，包括：
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9任一所述的多能干细胞或其衍生细胞或根据权利要求10至15任一所述的方法构建的多能干细胞或其衍生细胞，以及药学上可接受的载体。
17.根据权利要求1至9任一所述的多能干细胞或其衍生细胞、根据权利要求10至15任一所述的方法构建的多能干细胞或其衍生细胞或根据权利要求16所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中，所述肿瘤选自晚期或难治性肝细胞癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、胃食管交界处腺癌、胆管癌、尿路上皮癌和食管方形细胞癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌、胶质母细胞瘤、结直肠腺癌、垂体瘤、垂体腺瘤、垂体大腺瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、绒癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤、上皮样滋养细胞肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、肺腺癌和胶质肉瘤。
