本发明属于可视化核酸检测，具体涉及一种基于crispr/cas12a体系的可视化核酸检测方法。
背景技术：
：：1、在许多细菌和大多数古生菌中，存在规则成簇间隔的短回文重复序列，即crispr（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）序列。在cas（crispr-associated）效应蛋白的协助下，crispr/cas系统能够特异性结合靶标核酸，并作为获得性免疫系统，防御病毒和其他外来dna的侵入。其中，cas12a属于第2类v型cas蛋白，它在未激活时呈自抑制状态。当与特定的crrna（crispr-related rna）结合后，其构象将发生改变，从而形成cas12a-crrna二元复合物。该复合物能够特异性的识别靶标dna，并激活其核酸内切酶活性。被激活的cas12a能够特异性的顺式切割靶标dna，同时能够非特异性的反式切割周围的ssdna。该crispr/cas12a系统具有较高特异性和灵敏度，可作为核酸检测的新型生物传感平台。（1. horvath p, barrangou r. crispr/cas, the immune system ofbacteria and archaea. science, 2010, 327(5962): 167-170. 2. van dongen j e,berendsen j t w, steenbergen r d m, et al. point-of-care crispr/cas nucleicacid detection: recent advances, challenges and opportunities. biosensors andbioelectronics, 2020, 166: 112445. 3. li s, cheng q, liu j, et al. crispr-cas12a has both
cis- and
trans-cleavage activities on single-stranded dna. cellresearch, 2018, 28: 491-493.）
2、食源性微生物在食物与人类健康的紧密关系中，起着关键性的调节作用。随着社会的发展，人们物质生活不断地提高的同时，由食品中病原微生物所引起的食源性疾病也在不断爆发。其中，创伤弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌是比较常见的食源性病原微生物，由它们所引发的食物中毒事件频有发生，这不仅会造成严重的公共卫生问题，还会导致工业和商业的重大损失。因此，确保食品的安全性显得尤为重要。其中，传统的培养检测法需要2-3天的时间来得到初步结果，需要一周以上的时间进行确认。虽然简单易用且成本低，但整个过程耗时耗力，不适用于病原微生物的快速检测。为了克服传统方法的局限性，开发可用于快速有效检测食源性致病菌的技术，逐渐成为近年来研究者们广泛研究的热点。（4. harwooda v j, gandhib j p, wright a c. methods forisolation and confirmation of
vibrio vulnificusfrom oysters and environmentalsources: a review. journal of microbiological methods, 2004, 59(3): 301-316.）
3、现阶段食源性致病菌的检测技术主要包括免疫检测法和核酸检测法。（1）免疫检测法主要依赖于抗原抗体的特异性结合，通过免疫反应对样本中的抗原和抗体进行定性和定量的测定。目前，应用于食源性致病菌的免疫检测法主要包括酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，elisa）、侧流免疫层析法（lateral flow immunoassay，lfia）等。此类方法虽然操作简单、特异性好，但成本较高、耗时较长、灵敏度低。（2）核酸检测法是通过使用与特定核酸序列互补的短合成寡核苷酸杂交来检测目的生物体中的特定核酸序列。目前，应用于食源性致病菌的核酸检测法主要包括聚合酶链式反应（polymerasechain reactions，pcr）、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermalamplification，lamp）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymeraseamplification，rpa）等。此类方法虽然检测时间短、灵敏度高，但对检测仪器和检测人员的技术要求较高，难以实现现场即时检测。（5. marco-noales e, biosca e g, milán m, etal. an indirect immunofluorescent antibody technique for detection andenumeration of
vibrio vulnificusserovar e (biotype 2): delevopment andapplications. journal of applied microbiology, 2000, 89(4): 599-606. 6.bonnin-jusserand m, copin s, bris c l, et al.
vibriospecies involved inseafood-borne outbreaks (
vibrio choleraev. parahaemolyticusand
v. vulnificus):review of microbiological versus recent molecular detection methods inseafood products. critical reviews in food science and nutrition, 2019, 59(4): 597-610. 7. zhang m, liu j, shen z, et al. a newly developed paperembedded microchip based on lamp for rapid multiple detections of foodbornepathogens. bmc microbiology, 2021, 21: 197.）
技术实现思路1、本发明的目的在于克服传统食源性致病菌检测的技术缺陷，以食源性致病菌的特定基因作为检测目标，提供一种简便、快捷、灵敏、特异的检测方法。为此，本发明采用的技术方案如下：2、crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌，包括如下步骤：3、步骤一：借助raa核酸扩增技术对食源性致病菌的特定基因进行扩增；4、步骤二：在crrna的介导下，cas12a能够特异性识别和切割目的靶标，并激活反式切割活性，从而切割两端修饰有β-半乳糖苷酶和琼脂糖微球的ssdna，释放出β-半乳糖苷酶；5、步骤三：利用滤芯枪头，将游离的β-半乳糖苷酶过滤至枪头底部。6、步骤四：β-半乳糖苷酶催化枪头底部中的氯酚红-β-d-吡喃半乳糖苷溶液，产生颜色变化，由此实现对于食源性致病菌的检测。7、其中，步骤二中，cas12a浓度为50-250 nm，cas12a与crrna的浓度比为1:1-1:4。8、进一步地，raa扩增所用引物序列包括：9、用于扩增创伤弧菌
vvha基因和16s rdna的引物为：
10、
vvha-raa-f，即序列表seq id no.1序列：
11、5’-ccactgtttgaagcggaagcacacgttacact-3’；12、
vvha-raa-r，即序列表seq id no.2序列：
13、5’-tccaactgccgtgacagctccagccgttaa-3’；14、16s-raa-f1，即序列表seq id no.3序列：15、5’-atacggagggtgcgagcgttaatcggaatt-3’；16、16s-raa-r1，即序列表seq id no.4序列：17、5’-cccacgctttcgcatctgagtgtcagtatc-3’；18、用于扩增副溶血性弧菌
tlh基因、
tdh基因和
trh基因的引物为：
19、
tlh-raa-f，即序列表seq id no.5序列：
20、5’-acagaatacattgccaaagcgaagaacctt-3’；21、
tlh-raa-r，即序列表seq id no.6序列：
22、5’-tttcacttctggaacgccacggttgtagtt-3’；23、
tdh-raa-f，即序列表seq id no.7序列：
24、5’-aatcagatcaagtacaacttcaacattccta-3’；25、
tdh-raa-r，即序列表seq id no.8序列：
26、5’-ccactaccactctcatatgcttctacatta-3’；27、
trh-raa-f，即序列表seq id no.9序列：
28、5’-atcaatggtcataactatacgatggcagctc-3’；29、
trh-raa-r，即序列表seq id no.10序列：
30、5’-ctctcatatgcctcgacagtaacaaagtattc-3’；31、用于扩增单核细胞增生李斯特菌
hlya基因和16s rdna的引物为：
32、
hlya-raa-f，即序列表seq id no.11序列：
33、5’-taagtgggaaatctgtctcaggtgatgtagaac-3’；34、
hlya-raa-r，即序列表seq id no.12序列：
35、5’-taagtctccgaggttaccgtcgatgatttg-3’；36、16s-raa-f2，即序列表seq id no.13序列：37、5’-gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc-3’；38、16s-raa-r2，即序列表seq id no.14序列：39、5’-gagttgcagcctacaatccgaactgagaatagt-3’；40、用于扩增沙门氏菌
inva基因的引物为：
41、
inva-raa-f，即序列表seq id no.15序列：
42、5’-aatggaatgtctaacaaagaaattgccgag-3’；43、
inva-raa-r，即序列表seq id no.16序列：
44、5’-cgatagagtgaaggccaagtttagaaaata-3’。45、进一步地，针对上述扩增片段，步骤二中所用的crrna序列包括：46、用于检测创伤弧菌
vvha基因和16s rdna的crrna为：
47、
vvha-crrna，即序列表seq id no.17序列：
48、5’-uaauuucuacuaaguguagauuggugagaacggugacaaaa-3’；49、16s-crrna1，即序列表seq id no.18序列：50、5’-uaauuucuacuaaguguagauaaacuggcagacuagaguac-3’；51、用于检测副溶血性弧菌
tlh基因、
tdh基因和
trh基因的crrna为：
52、
tlh-crrna，即序列表seq id no.19序列：
53、5’-uaauuucuacuaaguguagauuucguacuuaaccuacgcaa-3’；54、
tdh-crrna，即序列表seq id no.20序列：
55、5’-uaauuucuacuaaguguagaugaugaaacuccagaauauuu-3’；56、
trh-crrna，即序列表seq id no.21序列：
57、5’-uaauuucuacuaaguguagauugguuauaaagaugguauuu-3’；58、用于检测单核细胞增生李斯特菌
hlya基因和16s rdna的crrna为：
59、
hlya-crrna，即序列表seq id no.22序列：
60、5’-uaauuucuacuaaguguagaucgguggcuccgcaaaagaug-3’；61、16s-crrna2，即序列表seq id no.23序列：62、5’-uaauuucuacuaaguguagauuacuauccauuguagcacgu-3’；63、用于检测沙门氏菌
inva基因的crrna为：
64、
inva-crrna，即序列表seq id no.24序列：
65、5’-uaauuucuacuaaguguagauuugaguaacaagacuaucag-3’。66、进一步地，β-半乳糖苷酶偶联序列linker-1和琼脂糖微球偶联序列linker-2分别为：67、linker-1，即序列表seq id no.25序列：68、5’-thiol-(t)74-tcagtgaatcgatctagtcagtcag-3’；69、linker-2，即序列表seq id no.26序列：70、5’-biotin-(t)74-ctgactgactagatcgattcactga-3’。71、其中，
vvha基因是指创伤弧菌种内保守的溶细胞素基因（cytolysin-haemolysin）；
72、
tlh基因是指副溶血性弧菌种内保守的非耐热性溶血素基因（thermolabilehemolysin）；
73、
tdh基因是指副溶血性弧菌与致病性相关的耐热性直接溶血素基因（thermostable direct hemolysin）；
74、
trh基因是指副溶血性弧菌与致病性相关的耐热性直接溶血素相关溶血素（tdh-related hemolysin）；
75、
hlya基因是指单核细胞增生李斯特菌种内保守的溶血素基因（hemolysin a）；
76、
inva基因是指沙门氏菌种内保守的侵袭蛋白基因（invasion protein a）；
77、linker-1是指5’端巯基修饰的与β-半乳糖苷酶通过化学法进行偶联的单链dna；78、linker-2是指5’端生物素修饰的与琼脂糖微球通过生物素和链霉亲和素结合进行偶联的单链dna。79、对各步反应时间进行优化：步骤二中，crispr/cas12a体系的反应温度为37℃，反应时间为30-120 min；步骤四中，颜色催化反应温度为37℃，反应时间为30-120 min。80、所用功能化微球的制备方法为：β-半乳糖苷酶通过4-（n-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐与修饰巯基的linker-1进行连接，琼脂糖微球通过链霉亲和素与修饰生物素的linker-2进行连接，最后linker-1和linker-2通过退火连接得到β-半乳糖苷酶-dna-琼脂糖微球复合物。81、由上述对本发明的描述可知，本发明提出了一种crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的新方法。与现有的检测方法相比，该方法具有灵敏度高、特异性好、快速高效、操作便捷、用户友好且价格低廉等优点，是一种具有广泛应用价值的创伤弧菌即时检测新平台。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤二中，cas12a浓度为50-250 nm，cas12a与crrna的浓度比为1:1-1:4。
3.如权利要求1所述的crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤二中，crispr/cas12a体系的反应温度为37℃，反应时间为30-120 min。步骤四中，颜色催化反应温度为37℃，反应时间为30-120 min。
4.如权利要求1所述的crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，在功能化微球的制备过程中：β-半乳糖苷酶通过4-（n-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐与修饰巯基的linker-1进行连接，琼脂糖微球通过链霉亲和素与修饰生物素的linker-2进行连接，最后linker-1和linker-2通过退火连接得到β-半乳糖苷酶-dna-琼脂糖微球复合物。
5.如权利要求1所述的crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤四中，颜色催化反应的催化剂为β-半乳糖苷酶，催化底物为氯酚红-β-d-吡喃半乳糖苷。
6.如权利要求1所述的crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤一中使用raa扩增方法，扩增所用引物序列包括：
7.如权利要求1所述的crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，步骤二中所用的crrna序列包括：
8.如权利要求1所述的crispr/cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，其特征在于，β-半乳糖苷酶偶联序列linker-1和琼脂糖微球偶联序列linker-2分别为：
技术总结本发明提供了一种CRISPR/Cas12a体系可视化检测食源性致病菌的方法，包括如下步骤：（1）通过RAA等温扩增技术对食源性致病菌的特定基因进行扩增；（2）在crRNA的介导下，Cas12a能够特异性识别和切割目的靶标，并激活反式切割活性，从而切割两端修饰有β‑半乳糖苷酶和琼脂糖微球的ssDNA；（3）利用滤芯枪头，将游离的β‑半乳糖苷酶过滤至枪头底部；（4）β‑半乳糖苷酶催化氯酚红‑β‑D‑吡喃半乳糖苷溶液，产生颜色变化，由此实现对于食源性致病菌的检测。该方法操作简便，成本低廉，不需要使用大型仪器，且灵敏度高、特异性好，具有一定的应用前景。
技术研发人员：徐志南,王紫怡,徐楚田,黄迪,司振军,方蒙君
受保护的技术使用者：杭州孚斯泰生物技术有限公司
技术研发日：技术公布日：2024/11/26
