本技术涉及酶工程，尤其涉及一种组氨酸甜菜碱硫化酶突变体，以及所述突变体在麦角硫因生产中的用途。
背景技术：
1、麦角硫因(ergothioneine，简称ert)是一种含硫的组氨酸衍生物。麦角硫因具有抗氧化、清除自由基及参与细胞内能量调节等功能，与已知的抗氧化剂维生素c和谷胱甘肽相比，其化学性能更稳定，抗氧化能力更显著，因此麦角硫因具有广泛的生物医药应用前景。
2、目前麦角硫因主要是通过化学合成法、提取法和生物发酵法获取。化学法合成具有功效的左旋麦角硫因十分困难，工艺繁琐且收率低，而提取法主要是通过对食用真菌进行化学萃取的方法来获取，成本高，产率低且会存留化学试剂。传统的微生物发酵法主要利用蕈菌等食用真菌发酵合成麦角硫因，但由于发酵周期长，产量仅为毫克级别，且分离纯化困难，因此不适用于大规模工业化生产。
3、近年来随着麦角硫因在好氧生物和厌氧生物中合成路径的解析，利用基因工程开发高产麦角硫因的基因工程菌株逐渐兴起。在原核生物中，以组氨酸和半胱氨酸为前体，麦角硫因由egtabcde基因簇编码的egtd，egtb，egta，egtc和egte 5个酶催化合成；在真核生物中，组氨酸经egt1催化两步反应生成组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜，随后经egt2催化生成麦角硫因；在厌氧生物中，前体物质组氨酸仅需eana，eanb两个酶经两步反应就可生成麦角硫因。
4、厌氧生物的麦角硫因合成途径由于路径简单，目前已被应用于越来越多的麦角硫因外源合成途径中。但是目前eanb野生型存在表达量低及催化活性低的问题，限制了麦角硫因的工业化生产。
技术实现思路
1、本技术提供了影响组氨酸甜菜碱硫化酶在麦角硫因合成中的催化效率的突变位点，以及在所述突变位点发生突变的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶。所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶具有改变的或基本不变的催化效率。在一些实施方案中，所述突变使得所述组氨酸甜菜碱硫化酶对麦角硫因合成的催化效率提升。在一些实施方案中，所述突变使得所述组氨酸甜菜碱硫化酶对麦角硫因合成的催化效率降低。本技术同时还提供了包含所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶的核酸编码序列的生物材料。并进一步提供了所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶及所述生物材料的用途。
2、具体地，本技术涉及：
3、1、工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，所述组氨酸甜菜碱硫化酶源自绿菌属细菌(chlorobium)，其包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变：第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位，其中各氨基酸位置编号由参比序列定义，所述参比序列如seqid no：1所示。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶包含的氨基酸序列与如seq id no：1所示的氨基酸序列相比，在以下位点的一个或多个存在突变：第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在除第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位以外的氨基酸位点还包括一个或多个突变。一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶仅在第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位中的一个或多个位点具有突变。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶包含的氨基酸序列与如seq id no：1所示的氨基酸序列相比，仅在以下位点的一个或多个存在突变：第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位。在一些实施方案中，所述组氨酸甜菜碱硫化酶是野生型的。在一些实施方案中，所述组氨酸甜菜碱硫化酶是突变体。在一些实施方案中，经过所述突变后，所述位点的氨基酸突变为20种天然氨基酸及非天然氨基酸中的任一种。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸为天然氨基酸的衍生物。在一些实施方案中，所述氨基酸突变为选自以下的任一种氨基酸：甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)、组氨酸(h)、2-氨基己二酸(aad)、3-氨基己二酸(baad)、beta-丙氨酸或beta-氨基丙氨酸(bala)、2-氨基丁酸(abu)、4-氨基丁酸或哌啶酸(4abu)、6-氨基己酸(acp)、2-氨基庚烷酸(ahe)、2-氨基异丁酸(aib)、3-氨基异丁烯酸(baib)、2-氨基庚二酸(apm)、2,4-二氨基丁酸(dbu)、脱氧麻黄碱(des)、2,2'-二氨基庚二酸(dpm)、2,3-二氨基丙磺酸(dpr)、乙基甘氨酸(etgly)、n-乙基天冬氨酸(etasn)、羟基赖氨酸(hyl)、异羟赖氨酸(ahyl)、3-羟脯氨酸(3hyp)、4-羟脯氨酸(4hyp)、异锁链素(ide)、异亮氨酸(aile)、n-甲基甘氨酸或肌氨酸(megly)、n-甲基异亮氨酸(meile)、6-n-甲基赖氨酸(melys)、n-甲基缬氨酸(meval)、正缬氨酸(nva)、正亮氨酸(nle)和鸟氨酸(orm)。
4、2、根据项1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其中：
5、所述第234位的氨基酸突变为非极性氨基酸，例如a、v、l、i、p、f、w或m；
6、所述第341位的氨基酸突变为碱性氨基酸(例如h、r或k)或非极性氨基酸(例如m、w、a、v、l、i、p、f或g)；
7、所述第389位的氨基酸突变为非极性氨基酸，例如a、g、v、l、i、p、f、w或m；
8、所述第160位的氨基酸突变为非极性氨基酸，例如a、g、v、l、i、p、f、w或m，和/或
9、所述第228位的氨基酸突变为非极性氨基酸，例如a、g、v、l、i、p、f、w或m。
10、3、根据项1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，所述第234位和/或第341位发生突变。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在第234位和第341位以外还具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶仅在第234位和第341位发生突变。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在第234位、第341位和389位中的一个或多个中发生突变。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶仅在第234位、第341位和389位中的一个或多个中发生突变。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在且仅在第234位、第341位和389位发生突变。
11、4.根据项1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，所述第234位突变为a，所述第389位突变为a，和/或所述第341位突变为a、h或m。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶的第234位突变为a，且341位突变为a、h或m。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶仅在第234位和第341位发生突变，其中第234位突变为a，且341位突变为a、h或m。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶所述第234位突变为a，所述第389位突变为a，和/或所述第341位突变为a、h或m。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶仅在第234位、第389位及第341位中的一个或多个处发生突变，且所述第234位突变为a，所述第389位突变为a，和/或所述第341位突变为a、h或m。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在且仅在第234位、第389位及第341位处发生突变，且所述第234位突变为a，所述第389位突变为a，和/或所述第341位突变为a、h或m。
12、5、根据项1至4中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其在以下的一个、多个或全部位点不为a：第158位、第159位、第179位、第183位、第184位、第186位、第219位、第221位、第224位、第225位、第226位、第227位、第231位、第233位、第311位、第325位、及第346位。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在158位及159位不为a。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在158位、159位及346位不为a。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶在158位、159位、186位、219位、226位、231位、311位、346位不为a。
13、6、根据项1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，所述第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位的氨基酸为：
14、a、s、g、c、及g；
15、r、a、g、c、及g；
16、r、s、a、c、及g；
17、r、s、g、a、及g；
18、r、s、g、c、及a；
19、r、s、a、h、及g；
20、r、s、a、m、及g；
21、r、s、a、h、及a；或
22、r、s、a、m、及a。
23、7、根据项1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其包含选自seq id no：2至seq idno：10中任一个所示的氨基酸序列，选自seq id no：2至seq id no：10中任一个所示的氨基酸序列的保守取代变体，或与seq id no：2至seq id no：10中任一个所示的氨基酸序列具有90％以上(例如91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.2％以上、98.4％以上、98.6％以上、98.8％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上)序列同一性的氨基酸序列。
24、8、根据项1-7中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其源自栖泥绿菌(chlorobium limicola)。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶与如seq idno：11或如seq id no：1所示的氨基酸序列具有80％以上序列同一性。在一些实施方案中，所述组氨酸甜菜碱硫化酶与如seq id no：11或如seq id no：1所示的氨基酸序列具有90％以上序列同一性(例如91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.2％以上、98.4％以上、98.6％以上、98.8％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上、99.7％、99.8％以上)。
25、9、根据项1至8中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其进一步包含相对于seq id no：11的一段氨基酸片段的缺失，所述氨基酸片段为位于所述氨基酸甜菜碱硫化酶n端的无序区域片段。
26、10、根据项9的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其中所述无序区域片段相当于如seqid no：11所示的氨基酸序列的1至29位以内的氨基酸。在一些实施方案中，所述无序区域相当于包含如seq id no：11所示的氨基酸序列的1至29位氨基酸。在一些实施方案中，所述无序区域相当于如seq id no：11所示的氨基酸序列的1至29位氨基酸。
27、11、生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
28、a1)编码项1-10中任一项所述组氨酸甜菜碱硫化酶的核酸分子；
29、a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；
30、a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体、或含有a2)所述表达盒的重组载体；
31、a4)含有a1)所述核酸分子的重组微生物、或含有a2)所述表达盒的重组微生物、或含有a3)所述重组载体的重组微生物。
32、12、根据项11所述的生物材料，其中所述重组微生物为厌氧菌或兼性厌氧菌。
33、13、根据项12所述的生物材料，其中所述重组微生物为大肠杆菌。在一些实施方案中，所述重组微生物源自大肠杆菌b菌株。一些实施方案中，所述重组微生物为大肠杆菌bl21(de3)菌株。
34、14、根据项1至10中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶或根据项11至13中任一项所述的生物材料在麦角硫因合成中的用途。在一些实施方案中，所述工程化组氨酸甜菜碱硫化酶或所述工程菌以组氨酸甜菜碱及聚硫化钾为反应底物生成麦角硫因。
35、15、根据项1至10中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶或根据项11至13中任一项所述的生物材料在制备含有麦角硫因的化妆品、食品和药品中的用途。
36、以上详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于此。在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本技术所公开的内容，均属于本技术的保护范围。本文描述的本技术的方面和实施方式包括“包含”，“组成”和“基本上由……组成”的方面和实施方式。
1.工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变：第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位，其中各氨基酸位置编号由参比序列定义，所述参比序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其中：
3.根据权利要求1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，所述第234位和第341位发生突变；优选仅在第234位和第341位发生突变，
4.根据权利要求1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，所述第160位、第228位、第234位、第341位、及第389位的氨基酸为：
5.根据权利要求1所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其包含选自seq id no：2至seqid no：10中任一个所示的氨基酸序列，或选自seq id no：2至seq id no：10中任一个所示的氨基酸序列的保守取代变体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其源自栖泥绿菌(chlorobium limicola)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶，其进一步包含一段氨基酸片段的缺失，所述氨基酸片段为位于所述氨基酸甜菜碱硫化酶n端的无序区域片段，优选地，所述无序区域片段相当于如seq id no：11所示的氨基酸序列的1至29位氨基酸。
8.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
9.根据权利要求1至7中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶或根据权利要求8中所述的生物材料在麦角硫因合成中的用途。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的工程化组氨酸甜菜碱硫化酶或根据权利要求8中所述的生物材料在制备含有麦角硫因的化妆品、食品和药品中的用途。
