本发明涉及基因工程或分子生物学领域，具体涉及一种生产四环素的基因工程重组菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、四环素类抗生素(tetracyclines)是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，自然分离的包括金霉素(ctc,chlotetracycline)、土霉素(otc,oxytetracycline)、四环素(tc,tetracycline)、去甲基金霉素(6-dct,6-demethylchlortetracycline))；半合成的四环素衍生物包括美他霉素(甲烯土霉素,methacycline)、强力霉素(多西环素或脱氧土霉素,doxycycline)、米诺环素(二甲胺基四环素，minocycline)、替加环素(丁甘米诺环素,tigecycline)等。
2、四环素(tetracycline)主要由金色链霉菌(streptomyces aureofacines)发酵产生。由于金色链霉菌遗传操作困难，选育也仅限于在该菌种中开展常规诱变选育，使得四环素发酵水平很多年都未见有显著提升，且文献报道很少。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种生产四环素的基因工程重组菌株及其构建方法和应用。
2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
3、一种生产四环素的基因工程重组菌株，重组菌株为出发菌株中土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶和/或土霉素合成相关基因c5a-c11a还原酶原位或异位被替换；所述出发菌株为能够生物合成土霉素的菌株。
4、所述重组菌株为出发菌株中土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶被来自四环素生物合成途径的c6羟基化酶原位或异位替换；和/或，出发菌株中土霉素合成相关基因c5a-c11a还原酶被来自四环素生物合成途径的c5a-c11a还原酶原位或异位替换。
5、所述能够生物合成土霉素的菌株为streptomyces rimosus、s.rimosus ls-ti 18(russian)、s.rimosus m4018(pfizer)或s.rimosus r6(zagreb)等，优选为streptomycesrimosus。
6、所述具有四环素生物合成途径的菌株为streptomyces aureofaciens、streptomyce viridofaciens、streptomyces sp.sf2575或dactylosporangiumsp.sc14051等，优选为streptomyces aureofaciens。
7、所述重组菌株为出发菌株中土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶被来自四环素生物合成途径的c6羟基化酶原位或异位替换；和/或，出发菌株中土霉素合成相关基因c5a-c11a还原酶被来自四环素生物合成途径的c5a-c11a还原酶原位或异位替换。
8、具体为：
9、所述的四环素c6羟基化酶基因是ctcn，所述四环素c5a-c11a还原酶基因是ctcm。
10、所述土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶oxys、c5a-c11a还原酶oxyr分别或者同时被四环素c6羟基化酶基因是ctcn、四环素c5a-c11a还原酶基因是ctcm原位替换。
11、进一步的说，
12、所述的c5a-c11a还原酶基因ctcm原位替换土霉素合成相关基因c5a-c11a还原酶oxyr，获得产四环素的基因工程重组菌株。
13、所述的c6羟基化酶基因ctcn原位替换土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶oxys，获得产四环素的基因工程重组菌株。
14、所述的c6羟基化酶基因ctcn和c5a-c11a还原酶基因ctcm同时原位替换土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶oxys和c5a-c11a还原酶oxyr，获得产四环素的基因工程重组菌株。
15、所述来自四环素生物合成途径的c6羟基化酶的碱基序列为seq id no:1中碱基所示；或与其具有至少30％氨基酸序列同源性的序列。
16、所述来自四环素生物合成途径的c5a-c11a还原酶的碱基序列为seq id no:2中碱基所示；或与其具有至少30％氨基酸序列同源性的序列。
17、一种所述的生产四环素的基因工程重组菌株的构建方法，利用dna同源重组，将能够生物合成土霉素的菌株中c6、c5羟基化酶原位或异位替换，从而获得生产四环素的重组菌株。
18、具体为：利用dna同源重组将四环素生物合成基因簇里的功能基因ctcm和/或ctcn原位或异位替换具有土霉素生物合成的菌株中土霉素生物合成的基因簇里的功能基因oxyr和/或oxys，从而获得生产四环素的重组菌株。
19、一种所述的生产四环素的基因工程重组菌株的应用，所述重组菌株在生产四环素或及其类似物中的应用。
20、一种生产四环素或及其类似物的方法，将所述重组菌株在30-35℃震荡培养收集发酵液，纯化即为生产四环素或及其类似物。
21、具体为，包括使用本发明所述的重组链霉菌或根据本发明所述产生重组链霉菌的方法获得的重组链霉菌，任选包括回收和纯化生产的四环素。
22、在一个实施方案中，本发明提供了一种生产四环素的方法，包括：在适于四环素产生的条件下培养本发明的重组链霉菌或通过本发明的方法获得的重组链霉菌，收获产生的四环素，任选进行分离或纯化。
23、在一个实施方案中，本发明提供了一种生产四环素的方法，包括：将本发明所述重组链霉菌或通过本发明的方法获得的重组链霉菌进行种子培养，然后接种发酵培养基并在适于四环素产生的条件下进行发酵，收获发酵液，任选分离和/或纯化产生四环素。
24、本发明所述种子培养和发酵培养可以使用本领域已知的任何合适方法、条件和材料。所述种子培养基和发酵培养基可以使用本领域已知的任何合适的培养基。进行纯化的方法可以使用本领域已知的任何合适方法和技术进行，例如包括但不限于层析萃取、结晶、树脂吸附、离子交换吸附、色层分离和hplc等。
25、通过对一个或多个基因的原位替换或者异位替换，将合成土霉素的菌株改造为合成四环素，为四环素类抗生素的高效低成本工业生产提供优良的基因工程菌株。
26、更具体的说：具体的取-80℃冻存菌株接茄形瓶斜面培养基(麸皮8％，琼脂2.5％，余量为水，灭菌即得)上37℃培养64-72h，转移至28-35℃再培养3-5d，后刮取孢子接种至种子培养基(玉米淀粉2％，黄豆饼粉0.5％，酵母粉0.7％，玉米浆0.1％，nacl 0.5％，caco30.3％，余量为水，调节ph值为7.2，灭菌即得)，28-35℃、250rpm培养24-36h作为一级种子，而后再按10wt％的接种量分别接种到二级种子培养基中(配方同一级种子)，28-35℃、250rpm培养24-30h作为二级种子，再按10wt％的接种量接种至发酵培养基(玉米淀粉8％，黄豆饼粉3％，玉米浆1％，nacl 0.5％，caco30.8％，，kh2po4 0.05％，(nh4)2so4 0.08％，mgso4 0.6％，余量为水；调节ph值为7.2，灭菌即得)，30-35℃250rpm培养5-8d后收集发酵液，板框过滤，收集菌体烘干成粉，最后根据用途不同进行四环素或及其类似物的提取纯化。
27、如本文所用，编码特定氨基酸序列的基因是指该基因在适当生物体(例如产土霉素的链霉菌，特别是龟裂链霉菌)中表达时生成具有所述氨基酸序列的蛋白质。所述基因包括编码所述氨基酸序列的编码序列，还可以包括调节所述基因表达的调控序列，例如启动子等。例如，编码seq id no：1、seq id no：2所示序列的基因ctcn和ctcm是指基因在链霉菌例如土霉素链霉菌中表达时产生具有特定活性的氨基酸序列，称之为蛋白质或酶；在本发明中，ctcn和ctcm基因不仅涵盖编码seq id no：1和seq id no：2所示核苷酸序列，也涵盖了调节其表达的调控序列，例如启动子等。
28、本发明所具有的优点：
29、本发明利用同源臂的原位替换质粒，通过接合转移的方式导入土霉素产生菌中，精确的将外源目标基因原位替换土霉素产生菌中的目标基因，将合成土霉素的菌株改造成直接合成四环素，最终基因工程重组菌株不再合成土霉素，开始合成四环素。
30、本发明方法可任意改造土霉素生产菌株，获得发酵水平更高的四环素基因工程菌，为四环素的工业生产提供优良菌种。
31、本发明方法利用土霉素生产菌株遗传操作更容易，四环素发酵水平高于改造前原始菌株土霉素的发酵水平，可将其用于高效合成和工业化生产四环素，且经进一步改造可获得一系列生物合成四环素类似物如去甲基四环素、金霉素、去甲基金霉素等基因工程高产菌种。本发明所涉及的技术方法和重组工程菌株具有重要的应用价值。
1.一种生产四环素的基因工程重组菌株，其特征在于：重组菌株为出发菌株中土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶和/或土霉素合成相关基因c5a-c11a还原酶原位或异位被替换；所述出发菌株为能够生物合成土霉素的菌株。
2.按权利要求1所述的生产四环素的基因工程重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为出发菌株中土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶被来自四环素生物合成途径的c6羟基化酶原位或异位替换；和/或，出发菌株中土霉素合成相关基因c5a-c11a还原酶被来自四环素生物合成途径的c5a-c11a还原酶原位或异位替换。
3.按权利要求1或2所述的生产四环素的基因工程重组菌株，其特征在于：所述能够生物合成土霉素的菌株为streptomyces rimosus、s.rimosus ls-ti 18(russian)、s.rimosus m4018(pfizer)或s.rimosus r6(zagreb)；所述具有四环素生物合成途径的菌株为streptomyces aureofaciens、streptomyce viridofaciens、streptomycessp.sf2575或dactylosporangium sp.sc14051。
4.按权利要求1或2所述的生产四环素的基因工程重组菌株，其特征在于：所述重组菌株为出发菌株中土霉素合成相关基因c6、c5羟基化酶被来自四环素生物合成途径的c6羟基化酶原位或异位替换；和/或，出发菌株中土霉素合成相关基因c5a-c11a还原酶被来自四环素生物合成途径的c5a-c11a还原酶原位或异位替换。
5.按权利要求4所述的生产四环素的基因工程重组菌株，其特征在于：所述来自四环素生物合成途径的c6羟基化酶的碱基序列为seq id no:1中碱基所示；或与其具有至少30％氨基酸序列同源性的序列。
6.按权利要求4所述的生产四环素的基因工程重组菌株，其特征在于：所述来自四环素生物合成途径的c5a-c11a还原酶的碱基序列为seq id no:2中碱基所示；或与其具有至少30％氨基酸序列同源性的序列。
7.一种权利要求1所述的生产四环素的基因工程重组菌株的构建方法，其特征在于：利用dna同源重组，将能够生物合成土霉素的菌株中c6、c5羟基化酶原位或异位替换，从而获得生产四环素的重组菌株。
8.按权利要求7所述的生产四环素的基因工程重组菌株的构建方法，其特征在于：利用dna同源重组将四环素生物合成基因簇里的功能基因ctcm和/或ctcn原位或异位替换具有土霉素生物合成的菌株中土霉素生物合成的基因簇里的功能基因oxyr和/或oxys，从而获得生产四环素的重组菌株。
9.一种权利要求1所述的生产四环素的基因工程重组菌株的应用，其特征在于：所述重组菌株在生产四环素或及其类似物中的应用。
10.一种生产四环素或及其类似物的方法，其特征在于：将权利要求1所述重组菌株在30-35℃震荡培养收集发酵液，纯化即为生产四环素或及其类似物。
