本发明涉及生物分子检测领域，具体涉及一种用于前列腺癌检测的尿液外泌体标志物组合及其应用。
背景技术：
1、前列腺癌是泌尿男性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。前列腺癌患者的生存时间与其临床诊断时恶性肿瘤分期密切相关，因此对前列腺癌高危人群进行“早筛、早诊、早治”是提高中国前列腺癌患者总生存率的有效手段。
2、细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是由细胞分泌的具有磷脂双分子层结构的囊泡，能够通过其携带的生物大分子，调节受体细胞的生物学特性，参与细胞的生理学和病理学过程。外泌体(exosome)是evs一个重要的亚群，内部包裹了蛋白、mrna和microrna等物质，它们是健康和疾病的细胞间近距离通讯的介质，参与肿瘤发生、发展、侵袭和转移等多个过程。同时，与其他体液相比，尿液具有取样安全、样本量大且无创等特点，研究发现尿液外泌体rna可作为标志物有效检测泌尿系统癌症。
3、目前前列腺特异性抗原(psa)和直肠指检(dre)是用于筛查男性前列腺癌的主要工具，但两者都有固有的局限性。psa不是癌症特异性的，psa水平可以在良性前列腺增生(bph)、前列腺炎症或下尿路感染等非癌症条件下升高。当psa在4～10ng/ml时，阳性穿刺率仅约20％；当psa在10～20ng/ml时，阳性穿刺率仅约30％。dre过度依赖医生的经验，且是一种有创、侵入式的检查。如何在提高穿刺阳性率的同时避免过度诊疗是前列腺癌早期筛查中面临的巨大挑战。
技术实现思路
1、为解决现有技术的不足，本技术提供了一种用于前列腺癌早期检测的尿液外泌体标志物组合及试剂盒，其通过非侵入的方法获得随机尿液样本，尿液样本在采集前无需dre，也不需要从尿液样本中分离获得细胞沉淀。通过联合检测前列腺癌相关基因表达，可以明显地提高肿瘤检出率，具有无创、精准、快速的特点。
2、为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：
3、本发明公开了一种用于前列腺癌检测的尿液外泌体标志物组合，所述标志物包括amacr和内参基因，以及选自foxa1，malat1，dlx1，hocx6，psma，pca3，ttty15-usp9y中的一种、两种或三种基因。
4、优选的，所述标志物包括amacr和内参基因，以及选自foxa1，malat1中的一种或两种基因。
5、优选的，所述标志物为amacr、内参基因、foxa1以及malat1。
6、优选的，所述内参基因选自spdef和klk3中的一种。
7、本发明公开了用于扩增所述的尿液外泌体标志物的扩增引物组，所述引物组包括：扩增amacr的引物，其上游引物序列如seq id no:1所示，下游引物序列如seq id no:2所示；扩增foxa1的引物，其上游引物序列如seq id no:4所示，下游引物序列如seq id no:5所示；扩增malat1的引物，其上游引物序列如seq id no:7所示，下游引物序列如seq idno:8所示；扩增hocx6的引物，其上游引物序列如seq id no:13所示，下游引物序列如seqid no:14所示；扩增dlx1的引物，其上游引物序列如seq id no:19所示，下游引物序列如seq id no:20所示；扩增psma的引物，其上游引物序列如seq id no:22所示，下游引物序列如seq id no:23所示；扩增pca3的引物，其上游引物序列如seq id no:25所示，下游引物序列如seq id no:26所示；扩增ttty15-usp9y的引物，其上游引物序列如seq id no:28所示，下游引物序列如seq id no:29所示。
8、优选的，所述引物组进一步包括：扩增内参基因spdef的引物，其上游引物序列如seq id no:10所示，下游引物序列如seq id no:11所示；扩增内参基因klk3的引物，其上游引物序列如seq id no:16所示，下游引物序列如seq id no:17所示。
9、优选的，还包括检测探针，其中检测amacr的探针序列如seq id no:3所示，检测foxa1的探针序列如seq id no:6所示，检测malat1的探针序列如seq id no:9所示，检测spdef的探针序列如seq id no:12所示，检测hocx6的探针序列如seq id no:15所示，检测klk3的探针序列如seq id no:18所示，检测dlx1的探针序列如seq id no:21所示，检测psma的探针序列如seq id no:24所示，检测pca3的探针序列如seq id no:27所示，检测ttty15-usp9y的探针序列如seq id no:30所示。
10、优选的，所述检测探针标记荧光报告基团，所述荧光报告基团选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe。
11、本发明公开了所述的标志物组合、所述的扩增引物组在制备检测前列腺癌的检测试剂中的用途。
12、优选的，所述检测通过检测患者尿液外泌体实现。
13、本发明公开了一种检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的扩增引物组。
14、优选的，所述试剂盒还包括提取尿液外泌体的试剂。
15、本发明公开了一种用于前列腺癌检测的尿液外泌体标志物组合，所述标志物包括：dlx1，hocx6，foxa1，malat1，psma，amacr，pca3，ttty15-usp9y，以及内参基因，所述内参基因可以是spdef或klk3。
16、优选的，所述标志物组合至少包含amacr、foxa1和spdef，或所述标志物组合至少包含amacr、malat1和spdef。
17、本发明公开了用于扩增所述的尿液外泌体标志物的扩增引物组，所述引物组包括：扩增amacr的引物，其上游引物序列如seq id no:1所示，下游引物序列如seq id no:2所示；扩增foxa1的引物，其上游引物序列如seq id no:4所示，下游引物序列如seq id no:5所示；扩增malat1的引物，其上游引物序列如seq id no:7所示，下游引物序列如seq idno:8所示。
18、优选的，所述引物组进一步包括：扩增spdef的引物，其上游引物序列如seq idno:10所示，下游引物序列如seq id no:11所示。
19、优选的，还包括检测探针，其中检测amacr的探针序列如seq id no:3所示，检测foxa1的探针序列如seq id no:6所示，检测malat1的探针序列如seq id no:9所示，检测spdef的探针序列如seq id no:12所示。
20、优选的，所述检测探针标记荧光报告基团，所述荧光报告基团选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe。
21、优选的，如seq id no:3所示的探针的荧光基团是fam；如seq id no:6所示的荧光基团是rox；如seq id no:9的探针的荧光基团是cy5；如seq id no:12所示的荧光基团是hex。
22、优选的，本技术如seq id no:3所示的探针的淬灭基团是bhq1；在一个具体的实施方案中，本技术如seq id no:6所示的探针的淬灭基团是bhq2；在一个具体的实施方案中，本技术如seq id no:12所示的探针的淬灭基团是mgb。
23、本发明公开了所述的标志物组合、所述的扩增引物组在制备检测前列腺癌的检测试剂中的用途。
24、优选的，所述检测通过检测患者尿液外泌体实现。
25、本发明公开了一种检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的扩增引物组。
26、优选的，所述试剂盒的检测样本是患者尿液外泌体。
27、优选的，所述试剂盒还包括提取尿液外泌体的试剂。
28、优选的，所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品。
29、第一方面，本技术提供的一种用于前列腺癌早期检测的尿液外泌体标志物组合，其特征在于，所述标志物包括尿液外泌体mrna生物标志物，所述尿液外泌体mrna生物标志物为dlx1，hocx6，foxa1，malat1，psma，amacr，pca3，ttty15-usp9y，以及内参基因，所述内参基因可以是spdef或klk3。
30、进一步地，所述尿液外泌体mrna生物标志物在前列腺癌患者的尿液外泌体中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。
31、第二方面，本技术提供了一种基于尿液外泌体生物标志物组合的前列腺癌预测模型。该模型的算法为：
32、输出值＝{ct(target 1)-ct(内参)}×a+{ct(target 2)-ct(内参)}×b+{ct(target 3)-ct(内参)}×c+……+{ct(target n)-ct(内参)}×n+m
33、式中a、b、c和n是系数，m为常数，均可通过逻辑回归或线性回归将等式的输出值拟合至现有数据集确定。系数a介于0～1之间；系数b介于0～1之间，优选的；系数c介于0～1之间；系数n介于0～1之间；常数m介于0～1之间。
34、在一些实施例中，上述算法的输出值用于预测患者是否处于低前列腺癌风险或高前列腺癌风险。例如使用上述算法所计算的输出值小于0.25的患者被鉴定为具有较低的前列腺癌风险，输出值等于或高于0.25的或者被鉴定为具有较高的前列腺癌风险。
35、本技术实施例3提供的外泌体标志物组合及预测模型能够较为准确的对psa在4～20ng/ml之间的临床样本进行早期筛查，如图3所示，标志物组合amacr+foxa1+malat1的auc＝0.9026，灵敏度85.5％，特异性82.4％，准确性83.5％。具有较好的临床诊断价值。
36、第三方面，本技术提供了一种前列腺癌早期检测的试剂盒。该试剂盒用于检测尿液外泌体中的amacr、foxa1、malat1和spdef的mrna表达水平，再用上述前列腺癌预测模型计算输出值并与截断值对比，分析受试者罹患前列腺癌的风险。
37、进一步的，本技术的试剂盒包括以下组分：含特异性识别amacr、foxa1、malat1和spdef的mrna序列的引物和探针的rt-qpcr反应液，含逆转录酶、dna聚合酶、udg酶的酶混合液，阳性质控品、阴性质控品。
38、更进一步的，本技术的试剂盒提供一组用于检测前列腺癌尿液外泌体标志物的引物和探针组合，所述组合包括分别检测amacr，foxa1、malat1和spdef的mrna的引物和探针，包括：
39、amacr上游引物：5'-gggctcgtttatcaccagtga-3'seq id no:1；
40、amacr下游引物：5'-cggctgaatccaaattcttca-3'seq id no:2；
41、amacr探针：5'-cccgccctgcacctctgctgtta-3'
42、seq id no:3；
43、foxa1上游引物：5'-ggcatgaaaccagcgact-3'seq id no:4；
44、foxa1下游引物：5'-tggtgttcatggtcatgtaggt-3'
45、seq id no:5；
46、foxa1探针：5'-cccggtcagcaacatgaactcagg-3'seq id no:6；
47、malat1上游引物：5'-ccccgtgccttttgatctag-3'seq id no:7；
48、malat1下游引物：5'-catgcccacaaggatccaa-3'seq id no:8；
49、malat1探针：5'-cccctcacctcgatgcagcca-3'seq id no:9；
50、spdef上游引物：5'-ggcgaagtgctcaaggacat-3'seq id no:10；
51、spdef下游引物：5'-caggagccacttctgcacatt-3'seq id no:11；
52、spdef探针：5'-acggcctgcaagctgctcaacatc-3'seq id no:12；
53、hocx6上游引物：5’-ccagaaagccagtatccagatttac-3’seq id no:13；
54、hocx6下游引物：5’-tctggtaccgcgagtagat-3’seq id no:14；
55、hocx6探针：5’-tagccgaccccactgtgcgaatt-3’seq id no:15；
56、klk3上游引物：5’-accagaggagttcttgac-3’seq id no:16，
57、klk3下游引物：5’-cagcatgaac ttggtcac-3’seq id no:17
58、klk3探针：5’-agaaacttcagtgtgtggacctcc-3’seq id no:18；
59、dlx1上游引物：5’-tcagctttacaacaatcccta-3’seq id no:19，
60、dlx1下游引物：5’-cagtcattagatcctgca-3’seq id no:20，
61、dlx1探针：5’-accacagaataatgccagtcaccac-3’seq id no:21；
62、psma上游引物：5’-tgcacagaagctcctagaaaaaatg-3’
63、seq id no:22
64、psma下游引物：5’-ttccagtaaagccaggtccaa-3’seq id no:23；
65、psma探针：5’-tggctcagcaccaccagatagcagc-3’seq id no:24；
66、pca3上游引物：5’-gctggaaatggacaaccac-3’seq id no:25；
67、pca3下游引物：5’-ccagctgagacctaatgcaag-3’seq id no:26
68、pca3探针：5’-acccacaaatgcgaggtgcttc-3’seq id no:27；
69、ttty15-usp9y上游引物：5-cccttggaaaaactggcctcata-3’seq id no:28，
70、ttty15-usp9y下游引物：5’-gcctatcaattgctgccttatata-3’seq id no:29，
71、ttty15-usp9y探针：5’-acacatactccacacagccaccagaat-3’seq id no:30。
72、在本技术中，探针荧光报告基团可以选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe，但不限于此。
73、在一些具体的实施方案中，本技术如seq id no:3所示的探针的荧光基团是fam；如seq id no:6所示的荧光基团是rox；如seq id no:9的探针的荧光基团是cy5；如seq idno:12所示的荧光基团是hex。
74、进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1、bhq2，或mgb。
75、在一个具体的实施方案中，本技术如seq id no:3所示的探针的淬灭基团是bhq1；在一个具体的实施方案中，本技术如seq id no:6和seq id no:9所示的探针的淬灭基团是bhq2；在一个具体的实施方案中，本技术如seq id no:12所示的探针的淬灭基团是mgb；
76、在一个具体的实施方案中，seq id no:15所示的探针的荧光基团是
77、fam，淬灭基团是bhq1；seq id no:18所示的荧光基团是hex，淬灭基团是bhq1；seqid no:21的探针的荧光基团是rox，淬灭基团是bhq2；seq id no:24所示的探针的荧光基团是fam，淬灭基团是bhq1；seq id no:27所示的荧光基团是hex，淬灭基团是bhq1；seq idno:30的探针的荧光基团是cy5，淬灭基团是bhq2；
78、进一步地，所述组合物中引物在rt-pcr反应体系中的终浓度为0.05μm～0.5μm，优选为0.2μm；所述组合物中探针在rt-pcr反应体系中的终浓度为0.05μm～0.3μm，优选为0.15μm。所述rt-pcr反应体系还包括tris缓冲液、镁离子、da/g/c/utps。所述镁离子终浓度为5mm、所述datp终浓度为0.4mm、所述dctp终浓度为0.4mm、所述dgtp终浓度为0.4mm、所述dutp终浓度为0.8mm。
79、本发明还涉及一种使用如上所述试剂盒在通过如下方法进行前列腺癌早期诊断的试剂盒中的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
80、a)采集可疑前列腺癌患者的随机尿液样本，从首段尿开始，采集体积为20～50ml；
81、b)从尿液样本中分离纯化外泌体；
82、c)提取外泌体中的rna；
83、d)使用上述本技术的amacr、foxa1、malat1和spdef基因的引物和探针组合物以及试剂盒对获得核酸进行荧光定量pcr扩增；
84、e)获得对应生物标志物的表达值，使用上述本技术的前列腺癌预测模型，
85、对受试者的患癌风险进行评估。
86、本技术提供的amacr、foxa1、malat1和spdef生物标志物组合前列腺癌患者的尿液外泌体中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。将该标志物组合构建预测模型，通过训练集对模型进行训练，测试验证集对模型进行优化，最终获得前列腺癌早期预测模型。
87、针对具有最高auc的标志物或标志物组合分别设计特异的引物和探针，结合荧光定量pcr的必要组分，对受试者进行尿液外泌体标志物检测，通过前列腺癌早期预测模型对受试者进行癌症和非癌症的分类和筛选。
88、本技术通过无创收集尿液样本并对其外泌体进行检测，分析了外泌体中和前列腺癌相关的mrna的表达情况，通过逻辑回归建立了前列腺癌早期筛查预测模型。所构建的前列腺癌早期筛查预测模型具有高灵敏度和高特异性的特点，最终可利用该模型对单个样本或多个样本进行癌症和非癌症的分类和筛选。
1.一种用于前列腺癌检测的尿液外泌体标志物组合，其特征在于，所述标志物包括amacr和内参基因，以及选自foxa1，malat1，dlx1，hocx6，psma，pca3，ttty15-usp9y中的一种、两种或三种基因。
2.根据权利要求1所述的标志物组合，其特征在于，所述标志物包括amacr和内参基因，以及选自foxa1，malat1中的一种或两种基因。
3.根据权利要求2所述的标志物组合，其特征在于，所述标志物为amacr、内参基因、foxa1以及malat1。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的标志物组合，其特征在于，所述内参基因选自spdef和klk3中的一种。
5.用于扩增权利要求1所述的尿液外泌体标志物的扩增引物组，其特征在于，所述引物组包括：扩增amacr的引物，其上游引物序列如seq id no:1所示，下游引物序列如seq idno:2所示；扩增foxa1的引物，其上游引物序列如seq id no:4所示，下游引物序列如seq idno:5所示；扩增malat1的引物，其上游引物序列如seq id no:7所示，下游引物序列如seqid no:8所示；扩增hocx6的引物，其上游引物序列如seq id no:13所示，下游引物序列如seq id no:14所示；扩增dlx1的引物，其上游引物序列如seq id no:19所示，下游引物序列如seq id no:20所示；扩增psma的引物，其上游引物序列如seq id no:22所示，下游引物序列如seq id no:23所示；扩增pca3的引物，其上游引物序列如seq id no:25所示，下游引物序列如seq id no:26所示；扩增ttty15-usp9y的引物，其上游引物序列如seq id no:28所示，下游引物序列如seq id no:29所示。
6.根据权利要求5所述的扩增引物组，其特征在于，所述引物组进一步包括：扩增内参基因spdef的引物，其上游引物序列如seq id no:10所示，下游引物序列如seq id no:11所示；扩增内参基因klk3的引物，其上游引物序列如seq id no:16所示，下游引物序列如seqid no:17所示；。
7.根据权利要求6所述的扩增引物组，其特征在于，还包括检测探针，其中检测amacr的探针序列如seq id no:3所示，检测foxa1的探针序列如seq id no:6所示，检测malat1的探针序列如seq id no:9所示，检测spdef的探针序列如seq id no:12所示，检测hocx6的探针序列如seq id no:15所示，检测klk3的探针序列如seq id no:18所示，检测dlx1的探针序列如seq id no:21所示，检测psma的探针序列如seq id no:24所示，检测pca3的探针序列如seq id no:27所示，检测ttty15-usp9y的探针序列如seq id no:30所示。
8.根据权利要求7所述的扩增引物组，其特征在于，所述检测探针标记荧光报告基团，所述荧光报告基团选自fam、hex、rox、vic、cy5、5-tamra、tet、cy3和joe。
9.权利要求1-4任一所述的标志物组合、权利要求5-8任一所述的扩增引物组在制备检测前列腺癌的检测试剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述检测通过检测患者尿液外泌体实现。
11.一种检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5-8任一所述的扩增引物组。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括提取尿液外泌体的试剂。
