本发明涉及天然产物提取分离，特别是涉及一种强化微藻多糖提取的方法。
背景技术：
1、微藻具有光合作用效率高、生长速率快、对环境的适应能力强等特点，其细胞中含有丰富的脂质、色素、蛋白质、多糖、维生素、微量元素等代谢产物，这些代谢产物具有重要经济价值，在医药、保健品、饲料、化工等领域有广泛的应用前景。
2、微藻多糖是微藻中所有高分子碳水化合物的总称，一般具有水溶性、高粘度等特点，具有很强的生理活性，如可以促进免疫、有抗肿瘤的作用；可以抗病毒，对冶疗aids也有一定的作用；可以降血糖、降血脂、抗凝血，还具有抗氧化、抗衰老的作用等等；且多数无毒，在开发成为海洋药物方面有较大的潜力。
3、微藻中多糖需要提取后使用，在微藻多糖提取过程中，不同的提取工艺对微藻多肽的空间结构、组成和理化性质都有不同程度的影响。一般微藻多糖的提取方法主要有：醇提取法、热水浸提法、碱浸提法、酶解提取法等。相对比而言，酶解提取法在工业生产中用量大，不经济；碱提取法会造成多糖生物活性的降低，提取率高的超临界流体提取，其费用高并且对仪器设备要求严格，也不符合经济性；目前的微藻多糖的提取最常采用热水抽提法，但热水提取多糖时，易引起多糖降解，从而影响多糖的生物活性，而且多糖的得率并不理想。
技术实现思路
1、基于此，本发明的目的在于，提供一种强化微藻多糖提取的方法，该方法采用低共熔溶剂对微藻多糖进行提取，强化了微藻中多糖的提取过程，活性成分不易破坏，具有成本低和提取率高的优点。
2、一种强化微藻多糖提取的方法，包括以下步骤：
3、s1：提取剂的制备
4、分别将氢键供体和氢键受体按照一定比例加入到反应容器中，加热搅拌得到无色透明液体，冷却至室温，得到低共熔溶剂(des)；然后加入一定比例的纯水得到提取剂；
5、s2：微藻多糖的提取
6、按照比例称取微藻藻粉，加入到步骤s1制备得到的提取剂中进行搅拌加热提取；提取结束后，将混合液离心得上清液；
7、s3：微藻多糖的醇沉
8、将步骤s2中得到的上清液置于旋转蒸发仪中负压浓缩至浓度为1g/ml，得到浓缩提取液，接着加入乙醇混合醇沉收集沉淀，冷冻干燥得微藻多糖；
9、s4：微藻多糖提取率的测定
10、采用苯酚硫酸法测定多糖提取率。
11、低共熔溶剂(des)是由氢键受体和氢键供体通过氢键作用相互缔合形成的，由于组分间形成的氢键和范德华力阻碍了体系的再结晶，进而降低了体系的熔点，因此低共熔溶剂的熔点低于各组分的熔点，其在常温条件下通常以液态的形式存在。
12、在步骤s1中，所述氢键受体为铵盐，具体地为氯化胆碱、乙酸胆碱、硝酸胆碱、氯化甜菜碱、乙基氯化铵或四甲基氯化铵其中的一种或多种。所述氢键供体为羧酸类化合物、醇类化合物或者胺类化合物中的一种或多种。
13、本发明提供的一种强化微藻多糖提取的方法，该方法采用低共熔溶剂作为萃取剂，低共熔溶剂中的氢键受体与纤维素分子链、半纤维素分子链上的羟基形成了氢键作用，使得纤维素和半纤维素的分子间及各自分子内的氢键作用减弱，从而降低了纤维素和半纤维素的聚合度和结晶度，有效地破坏微藻细胞壁的氢键，有助于细胞内的物质溶出和扩散，很大程度上提高了微藻多糖的提取率，强化了微藻中多糖的提取过程。同时由于低共熔溶剂由原料混合加热制得，制备方法简单、耗能低，能有效降低成本。
14、进一步地，在步骤s1中，氢键受体优选氯化胆碱。氯化胆碱通过分子中的cl-与纤维素或半纤维素中的羟基氢形成o—h…cl-连接，实现降低纤维素和半纤维素的聚合度和结晶度，实现微藻细胞壁发生降解的目的。
15、具体地，羧酸类化合物可以为乙酸、甲酸、酒石酸、草酸、乙酰丙酸等；醇类化合物可以是乙二醇、丙二醇、甘油等；胺类化合物可以是脲、硫脲、1,3二甲基脲、1,1二甲基脲等。
16、进一步地，所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1:1～5。
17、进一步地，步骤s1中的低共熔溶剂的制备条件为：在60-90℃下恒温搅拌2～3h，搅拌转速为400～800rpm，在该条件下，可以确保获得均一透明的低共熔溶剂。优选地，低共熔溶剂的制备条件为：80℃恒温加热搅拌2h。
18、进一步地，步骤s1中提取液中纯水的质量比为1～8％。优选地，纯水占提取液的质量比为5％。
19、需要说明的是，步骤s1中所有的材料在使用前均需在80℃的真空干燥箱中干燥24h。
20、进一步地，在步骤s2中，所述微藻藻粉为市售产品或培育所得，种类可以为小球藻、绿球藻或栅藻。
21、进一步地，在步骤s2中，所述微藻藻粉与提取剂的质量体积比为1:5～50g/ml，保证有足够的低共熔溶剂与微藻细胞壁作用，同时减少不必要的低共熔溶剂用量，降低了后续分离的难度和工作量。
22、进一步地，在步骤s2中，提取剂与微藻藻粉混合后，在70～100℃的恒温水浴中搅拌0.5～2h，搅拌转速为500～800rmp。避免温度过高，处理时间过长，引起多糖降解，从而影响多糖的生物活性。
23、优选地，步骤s2中提取条件为80℃恒温搅拌1h，搅拌转速为600rmp。
24、进一步地，在步骤s2中，提取结束后的离心条件为：4000～5000rpm，离心10min。
25、进一步地，在步骤s3中，浓缩提取液与乙醇(体积分数为95％)的体积比为1:5。
26、进一步地，在步骤s3中，旋蒸醇沉后的去除沉淀的溶液，去除该溶液液中的乙醇，得到低共熔溶剂，进行循环使用。
27、进一步地，在步骤s4中，标准曲线的绘制方法为：精确称量10mg标准葡萄糖置于100ml容量瓶中定容；取7支具塞玻璃试管，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml及1.0ml的葡萄糖溶液，并用超纯水补足体积至1.0ml，充分混匀后迅速置于冰浴中冷却5min，再吸取1ml多糖溶液于试管中，按顺序滴加5％苯酚溶液1ml和浓硫酸5ml，轻微震荡混合，于85℃水浴加热30min后取出，待其冷却至室温，精确移取200μl溶液，使用酶标仪在490nm处测定吸光度od值，得到标准曲线。
28、具体地，在步骤s4中，将微藻多糖样品溶解于超纯水中，接着加入超纯水进行稀释，再精确吸取1ml置于试管中，然后迅速置于冰浴中冷却5min，再吸取1ml多糖溶液于试管中，按顺序滴加5％苯酚溶液1ml和浓硫酸5ml，轻微震荡混合，于85℃水浴加热30min后取出，待其冷却至室温，精确移取200μl溶液，在490nm波长下测定吸光度od值；根据标准曲线计算多糖浓度，再按照下列公式计算样品中的多糖提取率：
29、多糖提取率＝(多糖浓度×待测体积×稀释倍数/多糖样品的质量)×多糖得率×100％
30、为了更好地理解和实施，下面结合具体实施方式详细说明本发明。
1.一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于：所述氢键受体与所述氢键供体的摩尔比为1:1～5。
3.根据权利要求2所述的一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于：步骤s1中，所述氢键供体和所述氢键受体在80℃恒温加热搅拌2h。
4.根据权利要求3所述的一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于：步骤s1中，所述提取液中纯水的质量比为5％。
5.根据权利要求1所述的一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于：步骤s2中，所述微藻藻粉与所述提取剂的质量体积比为1:5～50g/ml。
6.根据权利要求5所述的一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于：步骤s2中微藻多糖的提取条件为80℃恒温搅拌1h，搅拌转速为600rmp。
7.根据权利要求1所述的一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于：步骤s3中，所述浓缩提取液与乙醇的体积比为1:5。
8.根据权利要求1所述的一种强化微藻多糖提取的方法，其特征在于：步骤s4中，采用苯酚硫酸法测定多糖提取率。
