本发明属于生物医学领域，具体涉及一种解析ace2与新冠病毒接触界面关键位点的方法。
背景技术：
1、最近的covid-19大流行使ace2成为人们关注的焦点，许多研究已经阐明了ace2与这类冠状病毒中存在的刺突糖蛋白相互作用的分子细节，并部分解开了蛋白切割和细胞进入的机制，随着病毒的不断变异，了解ace2与sars-cov-2rbd结合的关键位点对于在分子水平上充分了解变异株的感染和免疫逃逸至关重要。除了人血管紧张素转换酶2(ace2)外，sars-cov-2的刺突糖蛋白对哺乳动物ace2受体同样具有广泛的宿主嗜性，尽管这些蛋白上刺突受体结合位点的氨基酸存在差异。有研究发现，在人ace2上相同位置的14个极性残基在与冠状病毒2019-ncov-spike形成结合界面中起着重要作用，其中，8个极性残基高度保守保证了其与新型冠状病毒的基本结合亲和力，其他不保守的极性残基对物种之间的结合模式有不同程度的影响。研究ace2作为新冠病毒spike蛋白受体的关键结合的机理，特别是其中关键位点对两者亲和力的确切影响，可以对预测新冠病毒的潜在宿主范围，抗体和疫苗的研发提供理论支持。
2、然而，有关物种ace2分子作为受体与sars-cov-2结合的关键亚结构域对于亲和力的贡献乃至对相关物种是否为新冠病毒潜在传播宿主的重要性方面仍尚未完全解开，需要进行更深入的研究，这对疫情防控、动物模型的建立和靶向药物的研发均有着重要意义。因此，仍需提供一种精确地研究ace2与新冠病毒接触界面关键位点的分析方法。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种解析ace2与新冠病毒接触界面关键位点的方法，能够快速预测ace2蛋白突变产生的影响进而筛选其重要位点，后续通过实验精确测得突变ace2与sars-cov-2rbd的亲和力和动力学参数，该方法尤其适用于从分子水平确定ace2与新冠病毒接触界面关键结合热点，相比于动物实验有独特的参考价值。
2、根据本发明的一个方面，提出了一种解析ace2与新冠病毒接触界面关键位点的方法，所述方法包括以下步骤：
3、s1、构建基于ace2蛋白序列的生物系统发育树，根据ace2蛋白与新冠病毒界面接触点对亚区域结构进行划分；
4、s2、将ace2蛋白与sars-cov-2rbd的复合物晶体结构利用mutabind2进行蛋白突变计算预测；
5、s3、利用spr技术测定不同物种ace2蛋白与sars-cov-2rbd的亲和力和动力学参数，分析得到ace2与新冠病毒接触界面关键位点。
6、在本发明的一些实施方式中，所述ace2蛋白包括但不限于人、猴、鼠、猫、狗、猪、白尾鹿、鸡、鸭和马的ace2蛋白。
7、在本发明的一些实施方式中，所述生物系统发育树采用mega-x软件构建得到。在mega-x软件中采用neighbor-joining计算方法，1000个重复，在测试(1000个重复)中，相关类群聚集在一起的复制树的百分比显示在分支旁边，进化距离使用p-distance方法计算。
8、在本发明的一些实施方式中，所述亚区域结构划分是通过ace2与sars-cov-2rbd的结合界面根据其空间结构和相互作用力划分得到的。
9、在本发明的一些实施方式中，所述亚区域结构包括cr1、cr2和cr3。
10、在本发明的一些实施方式中，所述cr1中sars-cov-2rod氨基酸位点包括a475、f486、n487和y489；所述cr1中ace2氨基酸位点包括q24、t27、f28、k31、l79、m82和y83。
11、在本发明的一些实施方式中，所述cr2中sars-cov-2rod氨基酸位点包括k417、y453、l455、f456和q493；所述cr2中ace2氨基酸位点包括t27、d30、k31、h34和e35。
12、在本发明的一些实施方式中，所述cr3中sars-cov-2rod氨基酸位点包括g446、y449、g496、q498、t500、n501、g502和y505；所述cr3中ace2氨基酸位点包括e37、d38、y41、q42、n330、k353、g354、d355、r357和r393。
13、在本发明的一些实施方式中，ace2与sars-cov-2rbd的复合物晶体结构的pdb id为6m0j和6lzg。
14、在本发明的一些实施方式中，mutabind2的使用通过从蛋白结构数据库(https://ww w.rcsb.org/)中获取关于sars-cov-2s蛋白与人ace2蛋白共晶的三维结构文件(pd bid:6lzg、6m0j)后，在mutabind2(https://lilab.jysw.suda.edu.cn/research/mutabind2/method)网站对蛋白复合物中的一些关键氨基酸残基进行突变计算，对于每种蛋白质/突变，mutabind2提供以下结果：
15、δδgbind(kcal/mol)是由突变诱导的结合亲和力的预测变化。如果δδg≥1.5kcal/mol则mutabind服务器将突变归类为有害突变，若δδg≤-1.5kcal/mol则认为突变会促进二者结合(计算结果由ddg显示)。利用获得的pdb文件(6m0j)在pymol软件中打开，观察其空间结构，根据其接触位点的空间结构以及各种作用力(如氢键，盐键)划分成三个不同的亚区域结构，即cr1、cr2、cr3区域，进一步通过序列对比将人ace2接触界面关键结构的氨基酸残基突变成不同物种相同位置的氨基酸残基，利用mutabind2网站突变计算。
16、在本发明的一些实施方式中，不同物种ace2蛋白包括但不限于人、猫、白尾鹿、小鼠的ace2蛋白，还包括突变的ace2蛋白。
17、在本发明的一些实施方式中，所述突变的ace2蛋白包括以人ace2(ace2为单体ace2(1-615))为骨架替换关键结构域为实验物种相同位置氨基酸残基的hace2突变株。
18、在本发明的一些实施方式中，所述不同物种ace2蛋白和sars-cov-2rbd为通过细胞工程方法进行诱导表达、纯化得到的蛋白。
19、在本发明的一些实施方式中，纯化不同物种ace2蛋白的标签为his tag。
20、在本发明的一些实施方式中，纯化sars-cov-2rbd的标签为fc tag。
21、在本发明的一些实施方式中，akta纯化仪进行纯化ace2蛋白步骤包括：将待纯化的ace2表达蛋白经镍柱采用亲和层析后，再采用分子筛纯化得到纯化后的表达蛋白。
22、在本发明的一些实施方式中，该亲和层析纯化采用的溶液包括镍柱平衡液和镍柱洗脱液。
23、在本发明的一些实施方式中，所述镍柱平衡液包括150～250mm nacl、15～25mmtris和15～25mm imidazole，ph为7.0～8.0。
24、在本发明的一些实施方式中，所述镍柱平衡液包括200mm nacl、20mm tris和20mmimidazole，ph为7.5。
25、在本发明的一些实施方式中，所述镍柱洗脱液包括450～550mm imidazole、15～25mmtris和150～250mm nacl，ph为7.5。
26、在本发明的一些实施方式中，所述镍柱洗脱液包括500mm imidazole、20mm tris和200mm nacl，ph为7.5。
27、在本发明的一些实施方式中，akta纯化仪进行纯化sars-cov-2rbd蛋白步骤包括：用akta纯化仪经protein a柱亲和纯化后在采用分子筛进一步纯化。
28、在本发明的一些实施方式中，亲和层析纯化溶液为ph3.5的柠檬酸和ph3.0的柠檬酸。
29、在本发明的一些实施方式中，分子筛纯化采用分子筛溶液和0.1m naoh溶液，通过双重纯化操作步骤获取高纯度的蛋白。
30、在本发明的一些实施方式中，所述分子筛溶液包括10mm pb和140mm nacl，ph为7.4。
31、在本发明的一些实施方式中，纯化后的蛋白浓度还包括采用bca法进行测定的步骤。
32、在本发明的一些实施方式中，所述spr测定使用protein a芯片进行。
33、在本发明的一些实施方式中，protein a芯片捕获携带有fc标签的sars-cov-2rbd，浓度为1g/ml，不同的ace2流经芯片表面，浓度范围为2000nm～31.25nm，两倍梯度稀释，使用biacore insight评估软件，1：1结合模型分析结合动力学。
34、在本发明的一些实施方式中，spr采用的溶液包括10mm hepes、0.005％tween-20、3mm edta、150mm nacl、配体sars-cov-2rbd和分析物ace2。
35、在本发明的一些实施方式中，配体sars-cov-2rbd的浓度为1g/ml，分析物ace2的浓度为0-2000nm。
36、在本发明的一些实施方式中，分析物ace2的浓度为2000nm、1000nm、500nm、250nm、125nm、62.5nm、31.25nm和0nm。
37、在本发明的一些实施方式中，所述亲和力和动力学参数分析采用biacoreinsight评估软件1：1langmuir结合模型进行分析。
38、根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案结合生物系统发育树、蛋白突变计算预测、序列分析以及spr实验将ace2与sars-cov-2rbd分区通过亚结构突变的影响解析ace2与新冠病毒接触界面的关键位点。基于ace2和sars-cov-2rbd的已知相互作用残基、不同物种ace2与人ace2结合残基的序列相似性以及计算预测氨基酸替代对sars-cov-2spike结合的影响进而通过spr实验验证来解析ace2与新冠病毒接触界面的关键位点，该方法可大规模预测不同物种的ace2对流行的rbd突变产生的新冠病毒跨种属ace2嗜性进而筛选出新冠病毒的潜在宿主范围且为抗体和疫苗的研发提供理论支持。
1.一种解析ace2与新冠病毒接触界面关键位点的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ace2蛋白包括但不限于人、猴、鼠、猫、狗、猪、白尾鹿、鸡、鸭和马的ace2蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚区域结构是通过ace2与sars-cov-2rbd的结合界面根据其空间结构和相互作用力划分得到的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物系统发育树采用mega-x软件构建得到。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，不同物种ace2蛋白包括但不限于人、猫、白尾鹿、小鼠的ace2蛋白，还包括突变的ace2蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变的ace2蛋白包括以人ace2为骨架替换关键结构域为不同物种相同位置氨基酸残基的hace2蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不同物种ace2蛋白和sars-cov-2rbd为通过细胞工程方法进行诱导表达、纯化后得到的蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纯化采用akta纯化仪进行。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，纯化不同物种ace2蛋白的标签为his tag；纯化sars-cov-2rbd的标签为fc tag。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述spr技术使用protein a芯片进行测定。
