本公开涉及限制进入反相色谱用于分析多核苷酸的用途。
背景技术：
1、多核苷酸是核苷酸(rna、dna和它们的类似物)的聚合序列，这些聚合序列广泛用作生命科学研究和基于dna的诊断测试试剂盒(作为引物和探针试剂)中的pcr(聚合酶链反应)试剂和基于微阵列的试剂。随着频率的增加，它们被开发为用于各种疾病病状的治疗药物。只有几种fda批准的基于多核苷酸的治疗药物现今在市场上出售，但存在超过100种当前处于临床管道中并且还有更多的处于早期开发阶段。
2、作为治疗剂开发的多核苷酸可以呈多种形式，从可以影响“基因沉默”的反义寡核苷酸(aso)、小干扰rna(sirna)、小发夹rna(shrna)、单向导rna(sgrna)和微rna(mirna)(“基因沉默”是下调或关闭特定基因/蛋白质的表达)；到表现为小分子药物并与特定疾病靶标结合的适体；到可以非常长并且设计用于上调特定蛋白质的表达的信使rna(mrna)。为了增强它们在体内的稳定性和/或细胞摄取，多核苷酸治疗剂常常并入经化学修饰的核苷酸，被聚乙二醇化、或以其他方式与其他化学部分缀合。并且和其他生物制剂一样，必须精确地了解和控制这些分子的生物物理特征和纯度以满足法规要求。
3、多核苷酸通常通过自动固相合成方法或从dna质粒的体内转录产生。长度在20至至多200个核苷酸范围内的寡核苷酸通常使用固相测序来制备，然而较大的多核苷酸(例如mrna)通常通过从dna转录来制备。例如，制备大多核苷酸的常用方法包括从头基因合成、逆转录和/或pcr扩增。根据应用，合成可用于制备纳克至千克的多核苷酸。虽然这些合成过程是有效的，但它们总是导致截断序列、未反应的试剂和其他需要分离和去除的过程相关副产物/杂质，以满足纯度要求。
4、用于治疗制剂中的多核苷酸与多种赋形剂混合。此类赋形剂可影响治疗性多核苷酸的性能和贮藏寿命。当进行多核苷酸制剂的分析时，可能需要评估制剂中活性多核苷酸的量。然而，赋形剂，特别是基于生物分子的赋形剂(诸如环糊精、脂质和糖类)的存在可能使此类分析复杂化。
5、高效液相色谱(hplc)已经成为用于纯化和分析多核苷酸的标准技术。反相液相色谱，特别是离子对反相液相色谱对于多核苷酸的分离和分析是特别有用的。尽管许多因素可有助于多核苷酸的色谱分离的成功，但多核苷酸分离质量的主要因素之一是吸附剂特性。影响分离的吸附剂特性包括吸附剂的表面化学、粒度、孔径和柱尺寸。
6、关于吸附剂的孔径，通常认为多核苷酸的分辨率随孔径的增加而提高。例如，sands等人，“characterization of bonded-phase silica gels with different porediameters”j.chromatogr.a.360(1986)353–369，发现蛋白质分离的分辨率随硅胶的孔径和孔体积的增加而增加，分辨率的增加对于较高分子量的蛋白质而言是最大的。wagner等人，“superficially porous particles withpores for large biomolecule highperformance liquid chromatography and polymer size exclusion chromatography”j.chromatogr a.2017march 17；1489:75–85，教导了生物感兴趣的较大分子需要大孔径，否则进出孔的传质速率将非常慢并且导致过度的区域变宽。wagner等人进一步教导了使孔径与分子尺寸匹配是极其重要的，特别是对于类似尺寸、形状和结构的分子要被分离的情况。close等人，“nucleic acid separations using superficially porous silicaparticles”j.chromatogr.a.1440(2016)135-144，用孔径为80a或150a的实芯颗粒分析了具有19-24个碱基对的寡核苷酸。close等人发现孔径为的吸附剂示出对寡核苷酸的受限扩散，从而产生与孔径的实芯颗粒相比更宽的峰。close等人注意到这些结果与肽分析所观察到的结果一致，其中在较大孔径的颗粒上观察到分辨率增加。
7、然而，大孔吸附剂的使用对于从工艺相关的副产物/杂质或赋形剂中分离多核苷酸而言不是理想的。当使用大孔吸附剂时，多核苷酸和杂质/赋形剂都被孔捕获，从而给多核苷酸的分离和分析带来问题。因此，希望以有效的方式实现从这些工艺相关的副产物/杂质中分离多核苷酸。
技术实现思路
1、多核苷酸，特别是mrna，已经成为有希望的治疗剂。例如，mrna是首个紧急获批的sars-cov-2疫苗的基础，并且它已经成功用于在全世界数百万患者中诱导中和抗体和t-细胞免疫。多核苷酸代表了生物技术中的突破，并且提供了用于在不依赖于细胞培养的情况下处理新抗原序列的适应性平台。mrna通常通过体外转录从dna质粒和无细胞酶促过程来制备。重要的转录后过程必须在该过程中发生，即添加5'末端帽和3'聚a尾部。必须分析mrna的完整性并且必须监测与其合成相关的杂质。
2、因为mrna是固有的大分子，它们具有非常慢的扩散系数，因此对需要开发新的分析分离技术的分析人员提出了重大挑战。传统的色谱分析集中于寡核苷酸，与mrna和其他多核苷酸相比，寡核苷酸的尺寸相对较小。由于它们相对较小的尺寸，色谱分析寡核苷酸(诸如小干扰rna和反义寡核苷酸)已经成为常见的做法，其中固定相可有利于有效的颗粒内扩散。通过使用具有直径在和之间的孔的吸附剂，可在寡核苷酸中实现颗粒内扩散。这一概念已被应用于较大的多核苷酸，诸如mrna和具有超过200个碱基对的多核苷酸，其通过简单地使用具有较大孔的吸附剂来进行(例如，参见wagner等人，j.chromatogr a.2017年3月17日；1489:75–85)。然而，大孔吸附剂的使用对于从工艺相关的副产物/杂质或赋形剂中分离较大的多核苷酸(例如，具有100个或更多个核苷酸长度的多核苷酸)而言不是理想的。当使用大孔吸附剂时，样品中大的多核苷酸和杂质/赋形剂都被孔捕获，从而导致难以分离和分析。
3、在令人惊讶的发现中，已经发现，不是试图将固定相的孔扩大到与多核苷酸尺寸相当的直径，而是选择孔径基本上从吸附剂中排除多核苷酸的吸附剂有效地产生大核酸的尖峰，其通过将大核酸限制成仅在多孔颗粒固定相的表面处进行吸附相互作用来进行。这种类型的对吸附剂的限制进入将大多核苷酸限制为主要与吸附剂进行表面相互作用。同时，颗粒的孔提供足够的表面，以通过颗粒内扩散对较小分子量物质(<5kda)实现有效分离。
4、在一个实施方案中，分离或纯化多核苷酸的方法包括：将包含一种或多种多核苷酸的样品注入色谱系统中，其中该色谱系统包括色谱柱，该色谱柱包含多孔吸附剂，其中该多孔吸附剂的平均孔径被选择成使得该多核苷酸基本上从该吸附剂孔中排除；以及在反相色谱条件下使该样品流过该色谱系统。
5、在一个实施方案中，多核苷酸具有至少100个核苷酸的长度。多核苷酸可以为rna。rna多核苷酸的示例包括mrna或sgrna。
6、在一个实施方案中，多孔吸附剂具有小于的平均孔径。该多孔吸附剂可具有小于的平均孔径。该多孔吸附剂可具有介于约至约之间的平均孔径。在一个实施方案中，多孔吸附剂是与c2-c18烃键合的二氧化硅。在一个实施方案中，一种或多种多核苷酸在多孔吸附剂中具有小于约10％的孔可进入性。多孔吸附剂可由平均粒径介于约1μm至约100μm之间的颗粒组成。
7、在一个实施方案中，样品包括多核苷酸的混合物。在一个实施方案中，样品包括一种或多种合成多核苷酸和与该一种或多种多核苷酸的合成相关联的杂质的混合物。该方法还包括从杂质中分离该一种或多种多核苷酸。在另一个实施方案中，样品包括一种或多种多核苷酸和与药物产品中的一种或多种多核苷酸的制剂相关联的赋形剂的混合物。该方法还包括从赋形剂中分离该一种或多种多核苷酸。
8、在一个实施方案中，色谱系统包括柱加热器。该方法包括将色谱柱加热至足以使样品中的双链多核苷酸变性的温度。
9、在一个实施方案中，反相色谱条件包括使用包含离子对试剂的极性流动相。
10、在一个实施方案中，该方法包括在一种或多种多核苷酸穿过色谱柱之后将一种或多种多核苷酸传递至检测器。检测器可以是质谱仪、光学检测器，或者可使用质谱和光学检测器两者。
1.一种分离和纯化多核苷酸的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸为rna。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述rna为mrna。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述rna为sgrna。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸具有至少100个核苷酸的长度。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多孔吸附剂具有小于或等于的平均孔径。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多孔吸附剂具有小于或等于的平均孔径。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多孔吸附剂具有介于约至约之间的平均孔径。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述多孔吸附剂是与c2-c18烃键合的二氧化硅。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述样品包含多核苷酸的混合物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述样品包含一种或多种合成多核苷酸和与所述一种或多种多核苷酸的合成相关联的杂质的混合物，并且其中所述方法还包括将所述一种或多种多核苷酸与所述杂质分离。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述样品包含一种或多种多核苷酸和与药物产品中所述一种或多种多核苷酸制剂相关联的赋形剂的混合物，并且其中所述方法还包括将所述一种或多种多核苷酸与所述赋形剂分离。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸在所述多孔吸附剂中具有小于约10％的孔可进入性。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述色谱系统还包括柱加热器，并且其中所述方法还包括将所述色谱柱加热至足以使所述样品中的双链多核苷酸变性的温度。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述反相色谱条件包括使用包含离子对试剂的极性流动相。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述多孔吸附剂由平均粒径介于约1μm至约100μm之间的颗粒构成。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述一种或多种多核苷酸穿过所述色谱柱之后，将所述一种或多种多核苷酸传递至检测器。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述检测器为质谱仪。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述检测器为光学检测器。
