背景技术：
1、致心律失常性心肌病是一种罕见的家族性疾病，通常出现在成年期，可能导致年轻、表面健康的个体出现室性心动过速(心率快)和心源性猝死。所述疾病的临床特征是室性心律失常(异常心跳)，主要起源于右心室。所述疾病的病理学标志是右心室心肌的纤维脂肪替换。症状通常包括胸部颤动或撞击感(心悸)、头晕和昏厥(晕厥)。随着时间的推移，患者可能会出现呼吸急促和腿部或腹部异常肿胀。如果心肌在疾病后期受到严重损害，则其可能会导致心力衰竭。
2、致心律失常性心肌病通常由编码蛋白质，诸如作为桥粒一部分的桥粒斑菲素蛋白(plakophilin)-2的基因的突变引起。桥粒是定位于细胞间连接的特化粘附蛋白复合物，其促进心肌细胞之间的附着，从而维持心肌组织的完整性。编码桥粒蛋白的基因的突变损害桥粒的功能，导致心肌损伤和心脏组织被脂肪或纤维化组织替换。
3、致心律失常性心肌病的标准护理包括使用药物(诸如β受体阻断剂和胺碘酮)、植入式心律转复除颤器(icd)和导管消融术来控制症状。因此，一直需要用于治疗致心律失常性心肌病的疾病缓解治疗组合物和方法。
技术实现思路
1、本公开提供了核酸分子，其包含腺相关病毒(aav)表达盒，其中所述aav表达盒从5'到3'包含：(i)5'aav反向末端重复序列(itr)；(ii)启动子；(iii)致心律失常性心肌病相关转基因；和(iv)3'aav itr。在一些实施方案中，启动子能够在心脏细胞中表达转基因。在一些实施方案中，启动子包括心脏肌钙蛋白t(tnnt2)启动子，例如包含核酸序列seq idno:4或与其具有至少90％同一性的序列的tnnt2启动子。在一些实施方案中，转基因编码桥粒斑菲素蛋白-2，例如包含seq id no:2的核酸序列或与其具有至少90％同一性的序列的转基因。在一些实施方案中，aav表达盒包含核酸序列seq id no:12或与其具有至少90％同一性的序列。
2、本公开还提供了质粒，其包含本文公开的任一种核酸分子；以及细胞，其包含本文公开的任一种核酸分子或质粒。此外，本公开提供了产生重组aav载体的方法，其包括将aav生产细胞与本文公开的任一种核酸分子或质粒接触。本公开还提供了重组aav载体，其通过本文公开的任一种产生重组aav载体的方法产生。在一些实施方案中，重组aav载体是单链aav(ssaav)。在一些实施方案中，重组aav载体是自身互补aav(scaav)。在一些实施方案中，aav载体包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav或牛aav的衣壳蛋白。
3、在一些实施方案中，与野生型aav衣壳蛋白相比，aav载体包含具有一个或多个取代或突变的衣壳蛋白。例如，在一些实施方案中，aav载体包含衣壳蛋白，其包含：(i)seq idno:13的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列，或(ii)seq id no:14的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列，或(iii)seq id no:15的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，aav载体包含衣壳蛋白，其包含seq id no:13的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，aav载体包含衣壳蛋白，其包含seq id no:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，aav载体包含衣壳蛋白，其包含seq id no:14的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，aav载体包含衣壳蛋白，其包含seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，aav载体包含衣壳蛋白，其包含seq id no:15的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，aav载体包含衣壳蛋白，其包含seq id no:15的氨基酸序列。本公开进一步提供了组合物，其包含本文公开的任一种核酸、任一种质粒、任一种细胞或任一种重组aav载体以及药学上可接受的载剂。
4、本公开还提供了在细胞中表达致心律失常性心肌病相关转基因的方法，其包括：将细胞与本文公开的核酸、质粒、细胞、重组aav载体或组合物中的任一种接触，从而在细胞中表达致心律失常性心肌病相关转基因。
5、本公开还提供了在组织中表达致心律失常性心肌病相关转基因的方法，其包括：将组织与本文公开的核酸、质粒、细胞、重组aav载体或组合物中的任一种接触，从而在组织中表达致心律失常性心肌病相关转基因。在一些实施方案中，组织包含至少一种细胞和至少一种桥粒连接。
6、在一些实施方案中，细胞是心脏细胞、内皮细胞、皮肤细胞、膀胱细胞或胃肠粘膜细胞。在一些实施方案中，细胞是心脏细胞。在一些实施方案中，接触步骤在体外进行、离体进行或在体内进行。在一些实施方案中，接触步骤在有需要的受试者体内进行。在一些实施方案中，接触步骤包括向受试者施用治疗有效量的核酸分子、质粒、重组aav载体或组合物。在一些实施方案中，受试者患有致心律失常性心肌病或处于发展致心律失常性心肌病的风险中。
7、本公开还提供了治疗有需要的受试者的致心律失常性心肌病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的核酸、质粒、细胞、重组aav载体或组合物中的任一种，从而治疗受试者的致心律失常性心肌病。在一些实施方案中，致心律失常性心肌病是致心律失常性右心室心肌病。在一些实施方案中，致心律失常性心肌病与基因突变相关，由基因突变促进或由基因突变引起。在一些实施方案中，基因突变包括pkp2基因中的突变。在一些实施方案中，pkp2基因中的突变导致pkp2单倍体不足。
8、在一些实施方案中，所述方法包括降低致心律失常性心肌病的严重性；延迟其发作或进展；和/或消除其症状。在一些实施方案中，致心律失常性心肌病的症状包括：(a)折返性室性心动过速、(b)晕厥、(c)猝死或(d)它们的任何组合。在一些实施方案中，致心律失常性心肌病与以下因素相关：(a)受试者心肌细胞之间的机械稳定性降低，(b)受试者心脏组织中的间隙连接受到破坏，(c)受试者心脏组织中钠电流的降低，(d)右心室心肌的纤维化，或(e)它们的任何组合。
9、在一些实施方案中，所述方法包括提高受试者心肌细胞之间的机械稳定性。在一些实施方案中，所述方法包括改善受试者心脏组织中的间隙连接的功能。在一些实施方案中，所述方法包括增加受试者心脏组织中的钠电流。在一些实施方案中，所述方法包括减少受试者右心室心肌的纤维化。
10、在一些实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，将核酸分子、质粒、细胞、重组aav载体或组合物施用于受试者的心脏组织。在一些实施方案中，将核酸分子、质粒、细胞、重组aav载体或组合物施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。在一些实施方案中，将核酸分子、质粒、细胞、重组aav载体或组合物通过静脉内施用、动脉内施用、主动脉内施用、直接心脏注射、冠状动脉灌注或它们的任何组合施用于受试者。
11、这些和其他实施方案将在下文陈述的详细描述中更详细地阐述。
1.一种核酸分子，其包含腺相关病毒(aav)表达盒，其中所述aav表达盒从5'到3'包含：
2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述启动子驱动所述致心律失常性心肌病相关转基因的表达。
3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述启动子能够在心脏细胞中表达所述转基因。
4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，其中所述启动子包括心脏肌钙蛋白t(tnnt2)启动子。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其中所述tnnt2启动子包含来源于以下的核酸序列：(i)人tnnt2启动子，(ii)鸡tnnt2启动子，(iii)小鼠tnnt2启动子，或(iv)它们的任何组合。
6.如权利要求5所述的核酸分子，其中所述tnnt2启动子包括人tnnt2启动子。
7.如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，其中所述tnnt2启动子包含核酸序列seqid no:4或与其具有至少90％同一性的序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的核酸分子，其中所述转基因编码桥粒斑菲素蛋白-2。
9.如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子，其中所述转基因编码人桥粒斑菲素蛋白-2。
10.如权利要求1-9中任一项所述的核酸分子，其中所述转基因编码人桥粒斑菲素蛋白-2的同种型2a。
11.如权利要求10所述的核酸分子，其中人桥粒斑菲素蛋白-2的同种型2a包含seq idno:1的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
12.如权利要求1-11中任一项所述的核酸分子，其中所述转基因编码pkp2基因的rna转录变体2a。
13.如权利要求1-12中任一项所述的核酸分子，其中所述转基因包含pkp2基因。
14.如权利要求13所述的核酸分子，其中所述pkp2基因是人pkp2基因。
15.如权利要求1-14中任一项所述的核酸分子，其中所述转基因包含seq id no:2的核酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
16.如权利要求1-15中任一项所述的核酸分子，其中所述5'itr和所述3'itr中至少一者的长度为约110至约160个核苷酸。
17.如权利要求1-16中任一项所述的核酸分子，其中所述5'itr与所述3'itr的长度相同。
18.如权利要求1-17中任一项所述的核酸分子，其中所述5'itr和所述3'itr具有不同的长度。
19.如权利要求1-18中任一项所述的核酸分子，其中所述5'itr和所述3'itr各自的长度均为约141个核苷酸。
20.如权利要求1-19中任一项所述的核酸分子，其中所述5'itr和所述3'itr中的至少一者分离自或来源于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav或牛aav的基因组。
21.如权利要求1-20中任一项所述的核酸分子，其中所述5'itr和所述3'itr各自分离自或来源于aav2的基因组。
22.如权利要求1-21中任一项所述的核酸分子，其中所述5'itr包含seq id no:5的序列。
23.如权利要求1-22中任一项所述的核酸分子，其中所述3'itr包含seq id no:6的序列。
24.如权利要求1-23中任一项所述的核酸分子，其中所述aav表达盒包含内含子。
25.如权利要求24所述的核酸分子，其中所述内含子来源于人β-珠蛋白基因。
26.如权利要求24或权利要求25所述的核酸分子，其中所述内含子包含seq id no:7的核酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的核酸分子，其中所述aav表达盒包含聚腺苷酸化信号。
28.如权利要求27所述的核酸分子，其中所述聚腺苷酸化信号是分离自或来源于下列基因中的一者或多者的聚腺苷酸化信号：猿猴病毒40(sv40)、rbg、α-珠蛋白、β-珠蛋白、人胶原、人生长激素(hgh)、多瘤病毒、人生长激素(hgh)或牛生长激素(bgh)。
29.如权利要求27或权利要求28所述的核酸分子，其中所述aav表达盒包含bgh聚腺苷酸化信号。
30.如权利要求29所述的核酸分子，其中所述bgh聚腺苷酸化信号包含seq id no:8的核酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
31.如权利要求1-30中任一项所述的核酸分子，其中所述aav表达盒包含至少一个填充序列。
32.如权利要求31所述的核酸分子，其中所述至少一个填充序列包含seq id no:9的核酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
33.如权利要求31所述的核酸分子，其中所述至少一个填充序列包含seq id no:9的核酸序列或其部分。
34.如权利要求1-33中任一项所述的核酸分子，其中所述aav表达盒包含kozak序列。
35.如权利要求34所述的核酸分子，其中所述kozak序列包含seq id no:10的核酸序列或与其具有至少90％同一性的序列；或acagccacc的核酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
36.如权利要求1-35中任一项所述的核酸分子，其中所述aav表达盒包含增强子。
37.如权利要求1-36中任一项所述的核酸分子，其中所述aav表达盒包含核酸序列seqid no:12或与其具有至少90％同一性的序列。
38.一种质粒，其包含如权利要求1-37中任一项所述的核酸分子。
39.一种细胞，其包含如权利要求1-37中任一项所述的核酸分子或如权利要求38所述的质粒。
40.一种产生重组aav载体的方法，所述方法包括将aav生产细胞与如权利要求1-37中任一项所述的核酸分子或如权利要求38所述的质粒接触。
41.一种重组aav载体，其通过如权利要求40所述的方法产生。
42.如权利要求41所述的重组aav载体，其中所述载体属于选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav和牛aav的血清型。
43.如权利要求41或权利要求42所述的重组aav载体，其中所述重组aav载体是单链aav(ssaav)。
44.如权利要求41或权利要求42所述的重组aav载体，其中所述重组aav载体是自身互补aav(scaav)。
45.如权利要求41-44中任一项所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aavrh32.33、aavrh74、禽aav或牛aav的衣壳蛋白。
46.如权利要求41-45中任一项所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含与野生型aav衣壳蛋白相比具有一个或多个取代或突变的衣壳蛋白。
47.如权利要求41-46中任一项所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含：
48.如权利要求47所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含seq id no:13的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
49.如权利要求48所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含含有seq id no:13的氨基酸序列的衣壳蛋白。
50.如权利要求47所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含seq id no:14的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
51.如权利要求50所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含含有seq id no:14的氨基酸序列的衣壳蛋白。
52.如权利要求47所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含seq id no:15的氨基酸序列或与其具有至少90％同一性的序列。
53.如权利要求52所述的重组aav载体，其中所述aav载体包含含有seq id no:15的氨基酸序列的衣壳蛋白。
54.一种组合物，其包含：(a)如权利要求1-37中任一项所述的核酸分子、如权利要求38所述的质粒、如权利要求39所述的细胞或如权利要求41-53中任一项所述的重组aav载体；以及(b)药学上可接受的载剂。
55.一种在组织中表达致心律失常性心肌病相关转基因的方法，其包括：将所述组织与如权利要求1-37中任一项所述的核酸分子、如权利要求38所述的质粒、如权利要求41-53中任一项所述的重组aav载体或如权利要求54所述的组合物接触，从而在所述组织中表达所述致心律失常性心肌病相关转基因。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述组织包含一种或多种细胞，以及一种或多种桥粒连接。
57.如权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述一种或多种细胞是心脏细胞、内皮细胞、皮肤细胞、膀胱细胞或胃肠粘膜细胞。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述一种或多种细胞是心脏细胞。
59.如权利要求55-58中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在体外进行、离体进行或在体内进行。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述接触步骤在有需要的受试者体内进行。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述接触步骤包括向所述受试者施用治疗有效量的核酸分子、质粒、重组aav载体或组合物。
62.如权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述受试者患有致心律失常性心肌病或处于发展致心律失常性心肌病的风险中。
63.一种治疗有需要的受试者的致心律失常性心肌病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-37中任一项所述的核酸分子、如权利要求38所述的质粒、如权利要求39所述的细胞、如权利要求41-53中任一项所述的重组aav载体或如权利要求54所述的组合物，从而治疗所述受试者的致心律失常性心肌病。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述受试者患有致心律失常性心肌病或处于发展致心律失常性心肌病的风险中。
65.如权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述致心律失常性心肌病是致心律失常性右心室心肌病。
66.如权利要求62-65中任一项所述的方法，其中所述致心律失常性心肌病与基因突变相关，由基因突变促进或由基因突变引起。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述基因突变包括所述pkp2基因中的突变。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述pkp2基因中的所述突变导致pkp2单倍体不足。
69.如权利要求62-68中任一项所述的方法，其中所述方法包括降低致心律失常性心肌病的严重性：延迟致心律失常性心肌病的发作或进展；和/或消除致心律失常性心肌病的症状。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述致心律失常性心肌病的症状包括：(a)折返性室性心动过速、(b)晕厥、(c)猝死或(d)它们的任何组合。
71.如权利要求62-70中任一项所述的方法，其中所述致心律失常性心肌病与以下相关：(a)所述受试者的心肌细胞之间的机械稳定性降低，(b)所述受试者的心脏组织中的间隙连接受到破坏，(c)所述受试者的心脏组织中的钠电流降低，(d)右心室心肌纤维化，或(e)它们的任何组合。
72.如权利要求62-71中任一项所述的方法，其中所述方法包括与患有致心律失常性心肌病的对照受试者相比，或与施用所述治疗有效量之前的所述受试者相比，提高所述受试者的心肌细胞之间的机械稳定性，其中所述对照受试者未被施用所述治疗有效量。
73.如权利要求62-72中任一项所述的方法，其中所述方法包括与患有致心律失常性心肌病的对照受试者相比，或与施用所述治疗有效量之前的所述受试者相比，改善所述受试者的心脏组织中的间隙连接的功能，其中所述对照受试者未被施用所述治疗有效量。
74.如权利要求62-73中任一项所述的方法，其中所述方法包括与患有致心律失常性心肌病的对照受试者相比，或与施用所述治疗有效量之前的所述受试者相比，增加所述受试者的心脏组织中的钠电流，其中所述对照受试者未被施用所述治疗有效量。
75.如权利要求62-74中任一项所述的方法，其中所述方法包括与患有致心律失常性心肌病的对照受试者相比，或与施用所述治疗有效量之前的所述受试者相比，减少所述受试者的右心室心肌纤维化，其中所述对照受试者未被施用所述治疗有效量。
76.如权利要求62-75中任一项所述的方法，其中所述方法包括与患有致心律失常性心肌病的对照受试者相比，或与施用所述治疗有效量之前的所述受试者相比，增加心脏的左心室射血分数，其中所述对照受试者未被施用所述治疗有效量。
77.如权利要求62-76中任一项所述的方法，其中所述方法包括与患有致心律失常性心肌病的对照受试者相比，或与施用所述治疗有效量之前的所述受试者相比，减少心脏的右心室面积，其中所述对照受试者未被施用所述治疗有效量。
78.如权利要求62-77中任一项所述的方法，其中所述方法包括与患有致心律失常性心肌病的对照受试者相比，或与施用所述治疗有效量之前所述受试者的预期存活期相比，延长所述受试者的存活期，其中所述对照受试者未被施用所述治疗有效量。
79.如权利要求60-78中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
80.如权利要求60-79中任一项所述的方法，其中所述核酸分子、所述质粒、所述细胞、所述重组aav载体或组合物施用于所述受试者的心脏组织。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述核酸分子、所述质粒、所述细胞、所述重组aav载体或组合物施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。
82.如权利要求60-81中任一项所述的方法，其中所述核酸分子、所述质粒、所述细胞、所述重组aav载体或组合物通过以下方式施用于所述受试者：静脉内施用、动脉内施用、主动脉内施用、直接心脏注射、冠状动脉灌注或它们的任何组合。
