不受CLSP阻碍物质影响的CLSP衍生物和CLSP活性的增强保护剂

不受clsp阻碍物质影响的clsp衍生物和clsp活性的增强/保护剂
技术领域
1.本发明涉及：钙调素样皮肤蛋白(calmodulin-like skin protein：clsp)的衍生物，其具有抑制与阿尔茨海默病(ad)相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的活性，并且不受阻碍物质(阻碍剂)对该活性的阻碍或抑制作用；clsp所具有的该活性(也称为“ad保护活性”、“抗ad活性”、“clsp活性”或“clsp的细胞毒性抑制活性”)的增强或保护剂，其由包含脂连蛋白的胶原同源区的多肽等构成；包含clsp或该clsp衍生物和该多肽等的融合蛋白；以及包含它们作为有效成分的药物组合物、特别是阿尔茨海默病治疗用药物组合物等。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(ad)是引起痴呆的主要的神经变性疾病。ad的病因尚未充分阐明，而且用于ad的疾病修饰(疾病的预防和进展抑制)疗法还处于远未实用化的阶段(1-3)。
3.作为生理活性肽的人体肽(humanin)和clsp是针对由睫状神经营养因子受体α、wsx-1和gp130构成的异源三聚体人体肽受体(hthnr)的生理学激动剂(4-6)。它们经由hthnr在体外阻碍ad相关神经元细胞死亡(5、7)。另外，clsp的转基因过度表达保护其在ad模型小鼠中免于突触丧失和记忆丧失(8)。然而，人体肽的活性弱(50%有效浓度为1～10μm) (6、7)，认为生物体内存在的人体肽的浓度不足以发挥神经保护效果(6、9)。
4.clsp主要在皮肤角化细胞中产生，在一部分外周组织的上皮细胞中也会产生少许(10-12)。通过clsp的腹腔内给药，小鼠的东莨菪碱诱发记忆障碍得到改善(13)。另外，在人脑脊液中存在足够量的clsp (14)。由这些实验事实推测：clsp从外周组织通过血液循环运输到达中枢神经系统(cns)，透过血脑屏障进入神经组织(14)。由clsp中的第40～61位的22个氨基酸构成的序列即her (内源性人体肽同源区)是clsp活性不可缺少的(5)，野生型clsp的活性比人体肽强105倍(50%有效浓度为10-100pm) (5)。另外，由测得的人脑脊液中的clsp的浓度(14)推测：cns中的clsp浓度是足以作为ad保护因子显示神经保护效果的浓度。由发表的这些见解(5、6、8、9、13和14)来看，体内的hthnr的核心激动剂很有可能是clsp而不是人体肽。另外，根据以前的研究(35)，暗示了在ad患者的cns中hthnr的活化水平降低。因此，作为进一步的推论，提出了在ad患者的cns中作为hthnr的核心激动剂的clsp水平有可能降低。然而，根据本发明人不久之前的研究(14)，否定了clsp水平本身在ad患者的cns中降低的可能性。
5.关于人体肽和clsp、以及它们的作用/效果，除上述以数字引用的参考文献(references)以外，在专利文献1中也有详细记载。
6.另一方面，脂连蛋白是来自脂肪组织的肽激素，其与脂连蛋白r1和脂连蛋白r2等受体结合以活化amp激酶介导的细胞内信号，从而显示增加胰岛素敏感性、胰岛素非依赖性的葡萄糖摄入、和分解脂肪酸等各种代谢作用。结果认为：该激素发挥抑制ii型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝病、以及代谢综合征和相关的代谢异常的作用。
7.如下所述，脂连蛋白的缺乏或脂连蛋白信号传递的异常调节与ad的发病相关的间
接性证据在多个研究中以初步数据的形式展示(31)。血清脂连蛋白水平的上升(29、30)有可能是ad的独立的危险因子(32)。反之，通过研究显示：在血清脂连蛋白浓度低的ii型糖尿病患者中出现ad样病情(33)。在ad患者的csf中脂连蛋白水平降低，与aβ水平的增加逆相关(30)。脂连蛋白敲除小鼠显示ad样症状和病理所见(34)。
8.现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第5939528号说明书。


技术实现要素：

9.发明所要解决的课题研究显示：除hthnr以外，clsp还与多种蛋白结合(15)，但它们的结合如何影响clsp功能尚未明确。
10.本发明的第一课题在于：研究这些clsp结合因子和本发明中新发现的clsp结合因子调节clsp活性的可能性，并对调节的蛋白进行其详细的机制分析。
11.第二课题在于：使用来自ad患者的样品确认在ad的中枢神经系统中clsp活性降低，同时研究这些clsp结合因子的异常有助于ad发病的可能性。
12.而且，第三课题在于提供：不受阻碍剂对clsp活性的阻碍或抑制作用的clsp衍生物、clsp和该clsp衍生物所具有的clsp活性的增强或保护剂、clsp或该clsp衍生物与增强或保护剂的融合蛋白、以及包含它们作为有效成分的用于抑制与阿尔茨海默病相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的药物组合物等。
13.用于解决课题的手段为了解决上述课题，本发明人深入研究的结果，在该技术领域中初次得到以下的见解，从而完成了本发明。
14.首先，发现clsp活性被载脂蛋白e (apolipoproteine：apoe；本实验中使用的apoe3和apoe4是有一个氨基酸不同的同族蛋白，生物化学性质基本相同)、14-3-3蛋白和钙网蛋白(calreticulin)等clsp阻碍物质(剂)抑制(图2和图3)。一系列的数据证实：这些clsp阻碍物质在与培养基中的clsp浓度同等～5倍的浓度下显示完全的clsp抑制效果。已知在人中枢神经系统中存在浓度绝对高于clsp浓度的apoe。例如，推测人脑脊液(csf)中的apoe浓度为40-200nm (18、19)，另一方面，推测clsp的浓度为3-6nm (14)。因此，若假定在体内的cns中clsp活性由仅由clsp及其阻碍物质构成的单纯体系规定，则认为通过这样的高浓度的内源性apoe使clsp的活性完全无效(实际上在正常生物体内，如后所述存在clsp保护物质以维持clsp活性(图5、图6、图7)。因此，作为治疗手段，为了通过使野生型clsp增加的方法体现在ad的中枢神经系统中降低的clsp活性(图10、11、表1、2、3、4)，必须使cns中的clsp浓度至少增加至40-200nm以上以克服clsp阻碍物质的阻碍。然而，由于clsp无法有效地透过血脑屏障而进入中枢神经系统(5、14)，所以这难以通过从外周路径给予野生型clsp来达成。例如，在小鼠中，在腹腔内注射5nmol野生型clsp的1小时后(通常预测达到最大浓度) csf和血清中的clsp浓度分别达到5nm和500nm (5)。因此，根据单纯的计算，为了在csf中上升至40-200nm以上的浓度，需要至少给予约10倍以上的野生型clsp。然而，上述实验中给予的5nmol对小鼠而言已经是非常多的量，现实中难以增加其以上给药量。即，通
过从外周注射野生型clsp而在cns中出现clsp活性几乎是不可能的。因此，为了通过外周给予clsp而在cns中出现clsp活性，必须进行如下的变更或设计：使clsp更有效地透过血脑屏障、和/或使clsp从clsp阻碍物质的阻碍效果中解放出来。
15.本发明人发现：apoe4经由clsp的c末端区(氨基酸62-146)与clsp结合(图9和补充图s4)。该见解显示：clsp的n末端区(氨基酸1-61：简称“clsp1-61”)不与apoe结合，而且不受apoe介导的抑制。重要的是，本发明人进一步证实：clsp1-61具有与野生型clsp同等的活性，抑制v642i-app诱导性神经细胞死亡(图l1)。实际上，完全阻碍v642i-app诱导性神经元死亡的、在大肠杆菌中产生的clsp1-61和野生型clsp的最小必需浓度同为0.5nm (图l1和图2)。
16.不出所料，由clsp1-61介导的v642i-app诱导性神经细胞死亡的抑制不仅不受apoe3的阻碍，也不受14-3-3σ蛋白或钙网蛋白这样的其他clsp阻碍剂的阻碍(图l2)。由以上证实：clsp1-61完全从clsp阻碍物质的抑制中解放出来，而且活性与野生型几乎同等，因此其是在体内以远低于野生型clsp的浓度显示clsp活性的clsp衍生物。
17.[seq id no: 1 clsp (1-146)]mageltpeeeaqykkafsavdtdgngtinaqelgaalkatgknlseaqlrklisevdsdgdgeisfqefltaakkaragledlqvafrafdqdgdghitvdelrramaglgqplpqeeldamireadvdqdgrvnyeefarmlaqe (根据遗传性多态性，第58位的s有时是g，但活性相同)进一步发现：脂连蛋白通过与clsp的her (内源性人体肽同源区)结合(图1和图9、图s4)，增强clsp活性(活性增强因子；图7)，并且保护(保持) clsp活性免受所有种类的clsp阻碍物质的阻碍(活性保护因子；图5、图6)。实际上，即使存在高达50nm的浓度绝对高的clsp阻碍物质，但如果存在0.2-0.25nm浓度的脂连蛋白，则ad相关细胞死亡也完全被1nm的clsp抑制(图5和图7)。该结果显示：在存在浓度绝对高于clsp的clsp阻碍物质的cns中，脂连蛋白是保持clsp的活性的clsp活性保护因子。
[0018]
进一步发现：通过使用临床样品进行实验，在ad患者中csf中的脂连蛋白的水平降低至0.3nm (图10、表1和2)。该结果与以前的研究结果一致(30)。还发现在ad患者中神经元内clsp信号强度降低(图11、表3和4)。若将这些结果一并考虑在内，则暗示在ad患者中因某种原因导致cns中的脂连蛋白水平降低，其结果是clsp活性降低、神经元对ad相关毒性敏感(即产生神经毒性)。
[0019]
本发明人还发现：脂连蛋白(adn)的胶原同源区(adncol：相当于and中的第45～104位的氨基酸序列)单独与clsp结合(图s4)，就足以显示clsp增强/保护活性(图l3和图l4)。重要的是，adncol的clsp增强/保护活性仅稍弱于野生型脂连蛋白的该活性的这个事实。实际上，用于赋予完全的clsp增强/保护活性的野生型脂连蛋白的最小浓度为0.2-0.25nm，而adncol的该最小浓度为0.5nm。另外，已知位于脂连蛋白的c末端的球形结构域对由普通的脂连蛋白受体adipor1和2介导的葡萄糖降低效果等脂连蛋白的代谢活性的调节是必须的(42)。因此，缺失了球形结构域的adncol缺乏脂连蛋白的这些代谢效果。即，缺失了球形结构域的adncol虽然与野生型adn同样具有完全的clsp活性增强/保护作用，但不同于野生型and，其无法与普通的脂连蛋白受体结合，其结果，认为没有显示所谓的代谢调节活性(可成为副作用的活性)。另一方面，在以前发表的研究(33、34)中，推测脂连蛋白的抗ad活性是由通过普通的脂连蛋白受体adipor1和2的结合而引起的代谢调节活性介导的。
[0020]
由上述内容预测：相对于野生型脂连蛋白，作为clsp增强/保护剂的adncol具有4个优点。第一，考虑到体内组织(cns或外周组织)中的普通脂连蛋白受体adipor1和2 (普通型脂连蛋白受体)的富裕度，推测有相当比例的野生型脂连蛋白被消耗于与普通型脂连蛋白受体形成复合体，相对于此adncol却不是这样。第二，暗示ad中的csf脂连蛋白水平的降低可能是源于因与神经元内的过度磷酸化tau形成不溶性复合体而被消耗(30)，但推测该过程是通过野生型脂连蛋白与普通型脂连蛋白受体结合且被神经元摄入而引起的。由于adncol不与普通型脂连蛋白受体结合，因此很可能不会与神经元中的过度磷酸化tau形成复合体。以上两点暗示：在体内显示clsp增强/保护活性所需的adncol量要较野生型脂连蛋白少。第三，大量的野生型脂连蛋白有可能通过与普通型脂连蛋白受体结合且活化各种代谢路径而引起副作用，但adncol不与普通受体结合，因此推测没有这样的副作用。第四，与野生型脂连蛋白的氨基酸长度(244个氨基酸：seq id no: 3)相比，adncol的氨基酸长度(60个氨基酸：seq id no: 2)相对较短，因此容易进行工业生产。根据上述的adncol的全部优点，adncol作为抗ad药也比野生型脂连蛋白优异。
[0021]
另外，本发明人发现：clsp或clsp衍生物与增强或保护剂的融合蛋白(杂交肽)对v642i-app诱导性神经细胞死亡具有较clsp1-61和野生型clsp强的保护活性(图l5)。即，用于完全抑制v642i-app诱导神经元细胞死亡的由clsp1-61和adncol构成的杂交肽(命名为“clspcol”)和由野生型clsp和adncol构成的杂交肽(命名为“wt-clspcol”)的最小浓度为0.1nm，clsp1-61和野生型clsp的最小浓度为0.5nm (图l5)。另外，clspcol和wt-clspcol不被clsp阻碍剂抑制，即使被抑制其程度也是轻度的(图x1和x2)。
[0022]
进一步发现：clspcol比wt-clspcol更有效地透过血脑屏障而转移到cns中(图l6和表1)。即，在小鼠中腹腔内注射10nmol的clspcol的1小时后，clspcol的浓度在含间质液(isf)的脑匀浆中为72nm、在血清中为320nm (图l6和表l1)。
[0023]
[adncol：seq id no: 2]ghpghngapgrdgrdgtpgekgekgdpgligpkgdigetgvpgaegprgfpgiqgrkgep[adn：seq id no: 3]mlllgavllllalpghdqetttqgpgvllplpkgactgwmagipghpghngapgrdgrdgtpgekgekgdpgligpkgdigetgvpgaegprgfpgiqgrkgepgegayvyrsafsvgletyvtipnmpirftkifynqqnhydgstgkfhcnipglyyfayhitvymkdvkvslfkkdkamlftydqyqennvdqasgsvllhlevgdqvwlqvygegernglyadndndstftgfllyhdtn即，本发明涉及以下方案。
[0024]
[方案1]钙调素样皮肤蛋白(calmodulin-like skin protein：clsp)衍生物(突变体)，所述衍生物的特征在于：包含内源性人体肽同源区(ehr)，该her是抑制与阿尔茨海默病相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的活性(clsp活性)中心，不包含该clsp活性阻碍剂所结合的区域。
[0025]
[方案2]方案1所述的衍生物，其中，her由氨基酸序列(i)构成：tgknlseaqlrklisevds (或g) dgd (氨基酸单字母表示) (i)。
[0026]
[方案3]方案1或2所述的衍生物，其中，阻碍剂所结合的区域是clsp (seq id no: 1)的c末端区的氨基酸序列(氨基酸62～146)。
[0027]
[方案4]方案1～3中任一项所述的衍生物，其是由以下的氨基酸序列构成的多肽：(1) clsp的n末端区的氨基酸序列(氨基酸1～61)；(2) 上述(1)的氨基酸序列中，在该氨基酸序列所含的ehr以外的氨基酸序列中有一个或多个(例如，2～5个左右)氨基酸被缺失、取代或插入而得的氨基酸序列；或者(3) 上述(1)的氨基酸序列中，相对于该氨基酸序列所含的ehr以外的氨基酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选98%以上的同一性的氨基酸序列。
[0028]
[方案5]方案1～4中任一项所述的衍生物，该衍生物不受阻碍剂对clsp活性的阻碍或抑制作用。
[0029]
[方案6]方案1～5中任一项所述的衍生物，其中，阻碍剂选自载脂蛋白e、14-3-3蛋白和钙网蛋白。
[0030]
[方案7]多肽，其由以下的氨基酸序列构成：(1) seq id no: 2所示的氨基酸序列(adncol)；(2) 包含上述(1)的氨基酸序列(adncol)的氨基酸序列；(3) seq id no: 3所示的脂连蛋白的氨基酸序列中，在该氨基酸序列所含的adncol以外的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被缺失、取代或插入而得的氨基酸序列；或者(4) 在seq id no: 3所示的脂连蛋白的氨基酸序列中，相对于该氨基酸序列所含的adncol以外的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
[0031]
[方案8]clsp或方案1所述的clsp衍生物所具有的clsp活性的增强或保护剂，其由方案7所述的多肽构成。
[0032]
[方案9]方案8所述的增强或保护剂，其特征在于：保护该clsp免受阻碍剂对clsp活性的阻碍或抑制作用，或者，使阻碍剂的该作用失效。
[0033]
[方案10]方案8或9所述的增强或保护剂，其中，上述多肽为脂连蛋白。
[0034]
[方案11]方案8～10中任一项所述的增强或保护剂，其中，阻碍剂选自载脂蛋白e、14-3-3蛋白和钙网蛋白。
[0035]
[方案12]融合蛋白，其包含clsp或方案1所述的clsp衍生物和方案7所述的多肽。
[0036]
[方案13]
方案12所述的融合蛋白，其由clsp的n末端区的氨基酸序列(氨基酸1～61)和adncol构成。
[0037]
[方案14]方案12或13所述的融合蛋白，其不受阻碍剂对clsp活性的阻碍或抑制作用。
[0038]
[方案15]药物组合物，其用于抑制与阿尔茨海默病相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡，包含方案1～6中任一项所述的clsp衍生物、方案7所述的多肽、方案8～11中任一项所述的增强或保护剂、或方案12～14中任一项所述的融合蛋白作为有效成分。
[0039]
[方案16]方案15所述的药物组合物，其用于预防或治疗伴有与阿尔茨海默病相关的记忆损伤或神经变性的疾病。
[0040]
[方案17]治疗伴有神经细胞的细胞功能障碍或神经细胞死亡的疾病、或伴有记忆损伤或神经变性的病症的方法，该方法包括：对患有或疑似患有该疾病或病症的个体给予方案15或16所述的药物组合物的阶段。
[0041]
[方案18]方案17所述的方法，其中，疾病或病症为阿尔茨海默病。
[0042]
[方案19]检测方案1～6中任一项所述的clsp衍生物、方案7所述的多肽、或方案8～11中任一项所述的增强或保护剂、或方案12～14中任一项所述的融合蛋白(将以上统称为“本发明多肽”)对与阿尔茨海默病相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的抑制活性的方法，该方法包括：工序(a)，在clsp的阻碍剂的存在/不存在下、和本发明多肽的存在/不存在下，诱导神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡；工序(b)，检测神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡；以及工序(c)，比较在本发明多肽的存在/不存在下的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡。
[0043]
[方案20]筛选调节方案1～6中任一项所述的clsp衍生物、方案7所述的多肽、或方案8～11中任一项所述的增强或保护剂、或方案12～14中任一项所述的融合蛋白(将以上统称为“本发明多肽”)或clsp对与阿尔茨海默病相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的抑制活性的物质的方法，该方法包括：工序(a)，在本发明多肽或clsp的存在下、在受试物质的有无下诱导神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡；工序(b)，检测神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡；以及工序(c)，选择调节本发明多肽或clsp对神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的抑制活性的物质。
[0044]
发明效果本发明的clsp衍生物包含内源性人体肽同源区(ehr)，该ehr是抑制与阿尔茨海默病相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的活性(clsp活性)中心，不包含像apoe、或14-3-3σ蛋白或钙网蛋白这样的clsp活性阻碍剂所结合的区域。
[0045]
其结果，clsp衍生物具有与野生型clsp相同程度的clsp活性，并且，实质上(显著)
不受该阻碍剂对clsp活性的阻碍或抑制作用。由以上显示：这些多肽被完全从clsp阻碍剂的阻碍/抑制中解放出来，在体内以远低于野生型clsp的浓度显示clsp活性。
[0046]
另一方面，由seq id no: 2所示的氨基酸序列构成且作为脂连蛋白的胶原同源区的多肽、和包含seq id no: 2所示的氨基酸序列的多肽、例如三聚体等多聚体脂连蛋白与位于clsp和本发明的clsp衍生物的clsp1-61内的ehr结合，具有增强它们所具有的clsp活性的作用/效果。
[0047]
而且，上述多肽具有以下的作用/效果：保护clsp免受载脂蛋白e等阻碍剂对clsp活性的阻碍或抑制，或者使该阻碍剂的阻碍或抑制作用失效。因此，上述多肽可用作与阿尔茨海默病相关的神经细胞的功能障碍或神经细胞死亡的抑制活性的增强或保护剂。
[0048]
另外，本发明的融合蛋白具有较由clsp或clsp的一部分构成的衍生物强的抗ad活性。另外，融合蛋白不受clsp阻碍剂的阻碍，或者即使受到阻碍也是极轻度的水平。进一步预测：该肽缺乏来自脂连蛋白的代谢相关活性，而且不会因与标准的脂连蛋白受体形成复合体而被消耗。除这些优点之外，作为融合蛋白之一的clspcol还具有其血脑屏障移动非常好的特征，所以可成为可外周给药的理想的抗ad药的可能性高。
附图说明
[0049]
[图1] 《载脂蛋白e3、e4和脂连蛋白与clsp结合》 通过转染使c末端用ha标记的载脂蛋白e3、e4、脂连蛋白和膜联蛋白ii在f11神经杂交细胞中过度表达。在转染的24小时后，回收f11细胞，调制细胞裂解物。相对于300μg的裂解物加入另外调整的结合有适量的gst-mychis或clsp-mychis的sepharose (琼脂糖凝胶) 4b，在4℃下培养一夜，彻底洗涤，然后进行pull-down沉降(沉淀)。将由细胞裂解物或与gst-mychis (gst-mh)和clsp-mychis (clsp-mh)结合的sepharose 4b珠粒构成的input、以及细胞裂解物的pull-down沉降物进行sds-page展开后，使用ha (血凝素a)和myc抗体进行免疫印迹分析。
[0050]
[图2] 《载脂蛋白e3和e4抑制clsp活性》 (a) 对于sh-sy5y细胞，转染pcdna3.1/mychis载体(载体)或pcdna3.2/mychis-v642i-app (v642i-app)。然后，在含有所示浓度的clsp-mychis的dmem/f12-10