本发明涉及糖生化分析领域，具体涉及一种分析还原糖的maldi反应型基质2-硝基-4-羧基苯肼。
背景技术：
1、还原糖是一类具有半缩醛还原末端的还原糖，广泛存在于自然界中，类型丰富多样，包括葡萄糖、麦芽糖等小分子低聚糖，由一系列不同聚合度的葡萄糖组成的大分子葡聚糖，以及从糖蛋白中酶解释放的 n-聚糖（ n-glycan）等等。其中， n-聚糖是通过 n-糖基化与蛋白质形成糖苷键的还原糖，在生物体的生命活动过程中发挥着重要的作用（xu, c. c.,davis, t.w.ng., glycosylation-directed quality control of protein folding.nature reviews molecular cell biology, 2015, volume 16, 742-752）。通过对 n-聚糖的表征可以揭示 n-糖基化在生物体内的动态变化，对糖生物学研究具有重要意义。
2、然而还原糖由于几乎不含有荧光基团和发色基团，缺乏容易离子化的位点故电离效率极低，以及存在高度复杂的异质性等缺点，因此直接对其分析检测具有很大的难度（kailemia, m.j., ruhaak, l.r., lebrilla, c.b., oligosaccharide analysis bymass spectrometry: a review of recent developments. analytical chemistry,2014, volume 86, 196），往往需要通过化学衍生化的方法在其结构上引入容易电离的极性基团来从根本上提高它的离子化效率。基质辅助激光解吸/电离质谱法（maldi-ms）由于具有软电离、耐盐性强、样品消耗少和样品制备方便等优点，已广泛应用于蛋白质、核酸、还原糖等各种高度异质性的生物大分子的检测（cai zongwei, liu shuying, applicationsof maldi tof spectroscopy, topics in current chemistry, 2013, 331）。2，5-二羟基苯甲酸（dhb）是检测还原糖最广泛使用的maldi基质，但它与分析物在靶板上易形成不规则的针状结晶，导致样品分布不均匀，信号重现性很差，检测灵敏度也有限，严重限制了它对还原糖的定性定量分析（jang, k.s., kim, y.h., rapid and robust maldi-tof mstechniques for microbial identification: a brief overview of their diverseapplications, journal of microbiology, 2018, volume 56, 209-216）。
3、反应型基质是集衍生化和maldi基质双功能于一体的试剂，可以与还原糖在maldi靶板上进行化学衍生后直接用于质谱分析，进一步简化了实验流程，提高了工作效率。本领域技术人员公知，理想的还原糖完全衍生化的衍生化产率（derivatization yield）为100%，衍生化产率与反应温度和反应时间呈正相关，反应温度越高或者反应时间越长，那么衍生化产率也会越高（zhao, x. y., guo, c., huang, y., huang, l. l., ma, g.,liu, y. q., he, q., wang, h. w., chen, k. s., pan, y. j., combinationstrategy of reactive and catalytic matrices for qualitative and quantitativeprofiling of n-glycans in maldi-ms. analytical chemistry, 2019, volume 91,9251-9258；ouyang d , huang h , he y ,et al.utilization of hydralazine as areactive matrix for enhanced detection and on-maldi-target derivatization ofsaccharides. chinese chemical letters, 2024, volume 35, 386-391.）。衍生化产率越高表明反应型基质对还原糖的衍生化越彻底，越有利于提高定量分析的准确性。如果衍生化反应不够彻底，那么在对复杂生物样品中还原糖的检测分析过程中，未衍生化的还原糖原料会严重增加图谱分析的复杂性，极大地降低定量分析的准确性，导致实验结果无法反映出真实的样品数据。由此可见衍生化产率越接近100%对于定量分析的准确性越好，因此现有技术只能通过提高反应温度或者延长反应时间尽可能提高衍生化产率使得其无限接近于理想值100%。但一方面延长反应时间会使得反应效率大大降低、成本升高；另一方面，对于生物样品来说反应温度越低则越温和，越有利于生物样品的检测，反应温度越高越会对生物样品中的糖分析物造成降解、破坏或带来其他复杂的副反应，不利于生物样品的定量分析检测。因此在生物样品的定量分析检测中，提高衍生化产率和降低反应温度、反应时间是相互矛盾的要求。
4、现有的还原糖检测提高衍生化产率是以升高反应温度为前提的，过高的反应温度不可避免的会对待检测的生物样品造成破坏，即使如此，现有的还原糖检测时反应温度达到65℃以上时其衍生化产率也只能达到95%以上，距离理想值100%还存在较大的差距，不能称作真正的完全衍生化。如申请人在前期的研究中所开发的2, 5-二羟基苯甲酰肼（dhbh）就是检测还原糖的一个经典的反应型基质，其与作为催化剂的酸性基质dhb构成的组合基质策略可以在65 ℃和30分钟的反应条件下实现还原糖的完全衍生化，需要明确的是，该文所认为的完全衍生化是指衍生化产率（derivatization yield）达到95%以上；如果想要将衍生化产率提高到99%以上，则要求反应温度提高到80 ℃以上（参见图1，来源于下述文献的supporting information中的图s6：zhao, x. y., guo, c., huang, y., huang, l.l., ma, g., liu, y. q., he, q., wang, h. w., chen, k. s., pan, y. j.,combination strategy of reactive and catalytic matrices for qualitative andquantitative profiling of n-glycans in maldi-ms. analytical chemistry, 2019,volume 91, 9251-9258）。衍生化产率在95%以上虽然可以基本满足定量分析的前提条件，但随着糖生物学的研究发展，提高定量分析的准确性对反应型基质的衍生化产率提出了更高的要求，95%的衍生化产率已经不能满足要求，需要做到99%以上甚至100%的衍生化产率，而现有技术想要提高衍生化产率采用的必要手段就是提高反应温度；而当反应温度达到80℃以上时，则不可避免的对生物样品中的糖分析物造成降解、破坏或带来其他复杂的副反应，不利于生物样品的定量分析检测。
5、同样的，其他已经报道的用于还原糖衍生化检测的反应型基质也只能达到95%以上的衍生化产率，且反应温度往往高于60 ℃，如3-氨基喹啉（3-aq，kaoru k., yuko f.,shinichi i., sadanori s., koichi t., highly sensitive maldi analyses ofglycans by a new aminoquinoline-labeling method using 3-aminoquinoline/α-cyano-4-hydroxycinnamic acid liquid matrix. analytical chemistry, 2011,volume 83, 3663-3667）、肼基烟酸（hynic, jiao j., yang l., zhang y.,hydrazinonicotinic acid derivatization for selective ionization and improvedglycan structure characterization by maldi-ms. analyst, 2015, volume 140,5475-5480）、2-苯基-3-(对氨基苯基) 丙烯腈（papan, ling, l., xiao, c. s., ma, y.,jiang, l. y., wang, s., guo, l. m., jiang, s. m., guo, x. h,. 2-phenyl-3-(p-aminophenyl) acrylonitrile: a reactive matrix for sensitive and selectiveanalysis of glycans by maldi-ms. analytical chemistry, 2019, volume 91, 8801-8807；中国专利cn108398482a）和喹啉-3-甲酰肼（q3ch, zhao, x. y., huang, y., ma,g., liu, y. q., guo, c., he, q., wang, h. w., liao, j. c., pan, y. j.,parallel on-target derivatization for mass calibration and rapid profiling of n-glycans by maldi-tof ms. analytical chemistry, 2020, volume 92, 991-998）等，且这些反应型基质都是应用于哺乳动物中 n-聚糖的分析检测。与哺乳动物相比，植物的 n-糖基化模式与哺乳动物存在巨大的差异（参见中国专利cn117969642b），如核心糖基修饰和末端糖基表位都有明显的不同，使得哺乳动物中相对成熟的 n-糖基化研究方法难以在植物中拓展应用，导致植物中 n-糖基化的研究相对滞后。其次，植物中糖蛋白的丰度更低，在糖链富集、纯化乃至表征过程中往往容易受到诸如色素、果胶等大量植物源污染物的干扰（nagashima yukihiro, antje von schaewen, hisashi koiwa. function of n-glycosylation in plants, plant science, 2018, volume 274, 70-79）。因此，对植物中 n-聚糖的表征分析更加困难。
6、综上所述，现有的已开发的反应型基质用于还原糖的衍生化分析检测存在两个问题：（1）为了提高衍生化产率而采用的必要手段是提高反应温度，通常的反应温度是60℃以上，为了达到衍生化产率99%以上的要求甚至需要反应温度达到80℃以上，但对于生物样品来说，升高反应温度不可避免地会对生物样品中的糖分析物造成降解、破坏或带来其他复杂的副反应，不利于生物样品的定量分析检测；（2）现有的还原糖在检测时即使提高了反应温度也无法实现真正的完全衍生化，现有的反应型基质反应温度达到60 ℃以上时其衍生化产率也只能达到95%以上，距离理想值100%还存在较大的差距，不能称作真正的完全衍生化。因此现有的反应型基质用于还原糖的衍生化分析检测无法在相对温和的条件（低于60℃）下实现真正的完全衍生化，无法满足日益增长的生物还原糖、尤其是检测难度更大的植物中 n-聚糖的高灵敏定性和高精准定量的分析需求，限制了糖生物学的深入研究和应用的开展。因此，开发用于植物中还原糖、尤其是 n-聚糖分析检测的maldi反应型基质以提高其基质性能和综合检测效果具有重要价值和意义。
技术实现思路
1、针对现有还原糖的maldi反应型基质存在的问题，本发明提供了一种分析还原糖的maldi反应型基质2-硝基-4-羧基苯肼，首次开发应用2-硝基-4-羧基苯肼（ncph）作为还原糖分析的maldi反应型基质，是理想的检测还原糖的基质；并且将ncph与dhb进行复合（ncph /dhb）可进一步提高其对还原糖的检测效果。本发明克服了现有技术为了实现完全衍生化（即尽可能提高衍生化产率接近100%）而必须采用提高反应温度导致生物样品在高温下受到破坏的技术偏见，本发明采用ncph /dhb复合在相对温和的条件下实现了还原糖的真正完全衍生化。相比于现有技术的反应型基质在60℃以上甚至65℃以上也只能实现95%以上的衍生化产率，与之相反的，本发明在maldi质谱中，基于ncph /dhb的高效靶板衍生化策略可以在比现有技术降低反应温度（55 ℃）的反应条件下实现对还原糖的真正完全衍生化检测，本发明所述的真正完全衍生化是指衍生化产率在99%以上，尤其是针对更加复杂和困难的植物 n-聚糖的定性定量分析具有优异的准确度。
2、本发明的第一个目的是提供2-硝基-4-羧基苯肼（ncph）作为maldi反应型基质在还原糖分析中的应用。所述还原糖定义为具有半缩醛还原末端的还原糖，可以包括葡萄糖、麦芽糖等低聚糖，由一系列不同聚合度的葡萄糖组成的葡聚糖，以及从糖蛋白中酶解释放的 n-聚糖等。
3、本发明所述的ncph结构式如式（1）所示：式（1）
4、本发明的第二个目的是提供ncph（2-硝基-4-羧基苯肼）和dhb（2，5-二羟基苯甲酸）的复合基质在maldi质谱中对还原糖分析中的应用。
5、在本发明的一个实施例中，所述2-硝基-4-羧基苯肼作为maldi反应型基质与2,5-二羟基苯甲酸优选的以1∶0.5～3.125的摩尔比进行组合；更优选的，摩尔比为1∶2.5。ncph为反应型基质，具有肼基反应性基团，可与还原糖的半缩醛末端进行反应。dhb为酸性催化剂，可显著促进ncph与还原糖的衍生化反应。
6、本发明所述ncph兼具maldi基质和衍生化试剂的双重功能，其本身具有辅助碳水化合物离子化的基质性能，而反应性能源于其结构上的肼基，可以与还原糖的半缩醛末端进行脱水反应生成稳定的腙，故过量的ncph无需纯化除去。dhb兼具maldi基质和催化剂的双重功能，其本身作为检测碳水化合物的传统maldi基质可以显著促进还原糖的解吸电离，而催化性能源于其结构上的羧基，可以提高反应体系的酸性从而极大地催化衍生化反应的进行，故dhb同样无需额外去除。因此，ncph与dhb的复合使用可以显著提高与还原糖的反应效率，与现有技术相比可以在靶板上实现温度更低、产率更高的真正完全衍生化反应，具体的表现为在反应温度为55 ℃时可以实现衍生化产率达到99%以上；同时ncph和dhb混合之后能够形成相当均匀的共结晶形态，在对 n-聚糖的衍生化检测过程中具有良好的信号重现性和定量准确度。
7、所述的在还原糖分析中的应用为对还原糖进行衍生化定性定量检测，所述的应用具体包括如下步骤：
8、1、试剂配制
9、以有机溶剂1和有机溶剂2的等体积混合溶剂配制ncph溶液，ncph为2-硝基-4-羧基苯肼；以有机溶剂1为溶剂配制dhb溶液，dhb为2, 5-二羟基苯甲酸；将ncph溶液和dhb溶液按等体积混合，配制ncph/dhb复合基质溶液；配制待测还原糖的酸性水溶液；所述有机溶剂1选自极性大于等于乙醇的与水互溶的极性有机溶剂中的任意一种或多种；所述有机溶剂2选自二甲亚砜（dmso）或n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中的任意一种或多种；本发明因为待测还原糖是溶解在水中的，因此极性大的溶剂可以更好地与水溶液混溶，而dmso和dmf具有广泛的溶解能力，能够溶解多种化合物，并与水及各类有机溶剂互溶，因此可以进一步增强反应型基质和糖分析物的充分反应。
10、2、点样
11、分别取等体积的待测还原糖的水溶液和ncph/dhb复合基质溶液，依次点在maldi靶板的同一个点样孔，在靶板上直接混合均匀，得到点样后的靶板。
12、3、靶板衍生化反应
13、点样后的靶板在45～65 ℃下放置20～40 min，混合样品点完全干燥，进行maldi质谱分析。
14、在本发明的一个实施例中，步骤1中，所述有机溶剂1选自甲醇、乙腈、乙醇中的任意一种或多种；
15、在本发明的一个实施例中，步骤1中，所述有机溶剂1和有机溶剂2为分析纯或色谱级溶剂；
16、在本发明的一个实施例中，配制还原糖水溶液的溶剂是超纯水或双蒸水；
17、在本发明的一个实施例中，所述的ncph溶液的浓度为0.02～0.10 mol/l；
18、在本发明的一个实施例中，所述的dhb溶液的浓度为0.025～0.125 mol/l；
19、在本发明的一个实施例中，步骤2中，待测还原糖水溶液的点样体积为0.5～1.5 μl；
20、在本发明的一个实施例中，ncph/dhb复合基质溶液的点样体积为0.5～1.5 μl；
21、在本发明的一个实施例中，待测还原糖的水溶液和ncph/dhb复合基质溶液的混匀使用移液枪在抛光靶板进行重复吸打10～20次；
22、在本发明的一个实施例中，所述的maldi质谱分析采用的检测模式为正离子线性或反射模式。
23、本发明的第三个目的是提供一种通过成腙反应用ncph在maldi靶板原位标记还原糖的试剂盒，该试剂盒可提供一个或多个容器，所述容器包含一定量的适用于所选数目的还原糖maldi靶板原位标记的ncph。
24、例如，方便地，可选择容器中的ncph的量足以标记384孔maldi靶板的孔中的还原糖样品。标记所用ncph相当少，～3 mg的ncph通常足以标记maldi靶板的384所有孔中的还原糖样品。所述试剂盒进一步包括一个或多个容器，包括：（a）含有ncph基质重结晶均匀粉末的容器，（b）含有dhb基质重结晶均匀粉末的容器，（c）含有适配ncph基质的溶剂的容器，（d）含有适配dhb基质的溶剂的容器，（e）含有足以使使用适配溶剂按照要求配置好的ncph基质溶液和dhb基质溶液进行等体积充分混匀的容器，（f）含有适配还原糖待测样品的酸性水溶液的容器。用于复配ncph的dhb基质重结晶均匀粉末的容器，含有2.5倍摩尔当量的dhb，一旦与ncph复配，可获得最优复配比例，即ncph与dhb的摩尔比为1:2.5。
25、在本发明的一个实施例中，所述ncph基质重结晶均匀粉末和所述dhb基质重结晶均匀粉末是经过重结晶工艺的高纯度粉末，所述高纯度指99.9%及以上。
26、在本发明的一个实施例中，所述适配ncph基质的溶剂是分析纯或色谱级的有机溶剂1和有机溶剂2的混合溶剂；所述适配dhb基质的溶剂是分析纯或色谱级的有机溶剂1；所述有机溶剂1选自极性大于等于乙醇的与水互溶的极性有机溶剂中的任意一种或多种；所述有机溶剂2选自二甲亚砜或n,n-二甲基甲酰胺中的任意一种或多种。
27、在本发明的一个实施例中，所述适配还原糖待测样品的酸性水溶液的酸是三氟乙酸或盐酸，水是双蒸水或单蒸水。
28、在本发明的一个实施例中，所述三氟乙酸是色谱级纯度。
29、本发明中所述的“maldi质谱”是指基质辅助激光解吸电离质谱（maldi-ms），简称为maldi质谱。maldi的工作原理是用特定波长的脉冲激光照射分析物与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给分析物分子使其解吸电离的过程。maldi是一种软电离技术，适用于生物大分子的测定。
30、本发明中所述的“反应型基质”是指作为常规基质辅助还原糖解吸电离的同时，可与其半缩醛还原端发生衍生化反应，共价结合离子化标签，提高电离效率。
31、本发明中所述的“靶板衍生化策略”是指在靶板上分析物的点样和衍生化同步进行，极大地简化了操作步骤，兼容了maldi的高通量特性。
32、本发明中所述的衍生化产率=衍生化产物峰强度/（衍生化产物峰强度+未衍生的峰强度）。
33、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
34、1、ncph可以辅助还原糖的解吸电离，具有作为maldi基质的性能。
35、2、ncph/dhb复合基质中，ncph为反应型基质，具有肼基反应性基团，可与还原糖的半缩醛末端反应。dhb为酸性催化剂，可显著促进ncph与还原糖的衍生化反应。ncph具有检测还原糖的基质性能，因此无需纯化分离，适用于靶板衍生化对还原糖进行分析检测。
36、3、由于衍生、催化和促进电离等多重效应，ncph/dhb复合基质具有优良的基质特性，可显著提高还原糖的离子化效率和检测灵敏度，拓展还原性多糖的质量检测范围。
37、4、本发明克服了现有技术为了实现完全衍生化（即尽可能提高衍生化产率接近100%）而必须采用提高反应温度导致生物样品在高温下受到破坏的技术偏见，本发明采用ncph /dhb复合在相对温和的条件下实现了还原糖的真正完全衍生化。相比于现有技术的反应型基质在60℃以上甚至65℃以上也只能实现95%以上的衍生化产率，与之相反的，本发明在maldi质谱中，基于ncph /dhb的高效靶板衍生化策略可以在比现有技术降低反应温度（55 ℃）的反应条件下实现对还原糖的真正完全衍生化检测，本发明所述的真正完全衍生化是指衍生化产率在99%以上，尤其是针对更加复杂和困难的植物 n-聚糖的定性定量分析具有优异的准确度。ncph与dhb的复合使用，还可以明显改善与还原糖的共结晶均匀度，具有良好的定量检测准确性和信号重现性（rsd<10%），在0.2～20 pmol/μl的范围内具有良好的线性相关性（r2>0.996）。
1.2-硝基-4-羧基苯肼（ncph）作为maldi反应型基质在还原糖分析中的应用。
2.2-硝基-4-羧基苯肼作为maldi反应型基质与2, 5-二羟基苯甲酸进行复合在还原糖分析中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的2-硝基-4-羧基苯肼如式（1）所示：式（1）。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的在还原糖分析中的应用为对还原糖进行衍生化定性定量检测，具体包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述的ncph溶液的浓度为0.02～0.10 mol/l。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述的dhb溶液的浓度为0.025～0.125 mol/l。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述的maldi质谱分析采用的检测模式为正离子线性或反射模式。
8.一种通过成腙反应用ncph在maldi靶板原位标记还原糖的试剂盒，所述试剂盒包括：（a）含有ncph基质重结晶均匀粉末的容器，（b）含有dhb基质重结晶均匀粉末的容器，（c）含有适配ncph基质的溶剂的容器，（d）含有适配dhb基质的溶剂的容器，（e）含有足以使使用适配溶剂按照要求配置好的ncph基质溶液和dhb基质溶液进行等体积充分混匀的容器，（f）含有适配还原糖待测样品的酸性水溶液的容器。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述ncph基质重结晶均匀粉末和所述dhb基质重结晶均匀粉末是经过重结晶工艺的高纯度粉末，所述高纯度指99.9%及以上。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述适配ncph基质的溶剂是分析纯或色谱级的有机溶剂1和有机溶剂2的混合溶剂；所述适配dhb基质的溶剂是分析纯或色谱级的有机溶剂1；所述有机溶剂1选自极性大于等于乙醇的与水互溶的极性有机溶剂中的任意一种或多种；所述有机溶剂2选自二甲亚砜或n,n-二甲基甲酰胺中的任意一种或多种。
