本发明属于杂交瘤细胞制备，具体涉及一种基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法的开发及应用。
背景技术：
1、细胞融合是单克隆抗体制备的关键环节，融合好坏决定筛选的阳性克隆的比率，因此需要对细胞融合过程进行把控。目前，电融合技术已广泛应用到杂交瘤细胞生产方向。电融合是使用短而强的脉冲电场，增加细胞膜的通透性，脉冲电场在细胞膜上产生局部穿孔，从而诱导细胞融合。电融合效率比常规聚乙二醇方法高的多，可以产生更多的融合细胞。但是，由于两种异源细胞间大小存在差异，在融合池中无法保证两种异源细胞相互接触形成杂交瘤细胞，存在同源细胞相互融合的情况，导致杂交瘤融合率低及阳性率低等问题出现。
2、链霉亲和素（streptavidin, sa）是由链霉菌分泌的一种大约55 kda的蛋白，它和生物素（biotin）具有非常独特的亲和性，是自然界中最强的非共价连接之一。一种sa蛋白能够以高亲和力和选择性结合四种biotin分子，它们形成的复合物非常稳定，可以与需要偶联、固定的分子、标签或支持物连接在一起，不易解离。sa-biotin系统具有亲和力高、特异性强、稳定性好等特点，因而广泛用于生物学研究中。因此，利用sa-biotin系统标记两种异源细胞，能够大大增加两种异源细胞接触率，提高细胞融合率和阳性率。
技术实现思路
1、本发明的目的是克服现有的传统细胞融合的技术缺点，提供了一种基于sa-biotin桥梁制备杂交瘤细胞的细胞标记改良电融合方法。本发明旨在通过sa、biotin标记待融合细胞，增加电融合排列过程异源细胞的接触机会，来减少相同细胞融合的几率，进一步提高电融合法制备杂交瘤细胞的融合效率，最大程度提高筛选项目的阳性率。
2、本发明具体是通过如下技术方案实现的：
3、本发明提供了一种基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法，包括如下步骤：
4、1）分别取小鼠脾细胞、sp2/0骨髓瘤细胞制成细胞悬液，加入生物素进行标记反应，得到biotin标记脾细胞和biotin标记sp2/0骨髓瘤细胞，重悬备用；
5、2）向步骤1）所得biotin标记脾细胞的悬液中加入链霉亲和素进行sa标记反应，得到sa标记脾细胞，重悬备用；
6、3）将所得biotin标记sp2/0骨髓瘤细胞与sa标记脾细胞混合均匀，用电融合缓冲液清洗后加入提前用电融合缓冲液润洗的电融合仪的融合室中进行细胞融合，形成含有杂交瘤细胞的融合子，最后进行阳性筛选。
7、进一步地，步骤1）所述细胞悬液采用dpbs制备，悬液中细胞密度为1.0×107~2.5×107个/ml；优选2.5×107个/ml。
8、进一步地，步骤1）中生物素标记反应采用sulfo-nhs-lc-biotin，sulfo-nhs-lc-biotin标记用量为35-70 μg/ml；优选50 μg/ml。biotin使用sulfo-nhs-lc-biotin进行标记反应，其具有水溶性好的优点，长链lc片段可减少与sa的空间位阻，有利于两者快速交联反应，同时带有nhs活性酯可一步交联，标记效率高。
9、进一步地，步骤2）中biotin标记脾细胞的悬液中链霉亲和素的标记用量为35-70μg/ml；链霉亲和素与生物素的质量比为1:1。
10、进一步地，步骤3）中biotin标记sp2/0骨髓瘤细胞与sa标记脾细胞混合的数量之比为1:(2-5)；优选1:2。
11、进一步地，步骤3）中电融合仪设置参数包括三个交流电场、一个直流脉冲电压：第一个交流电场参数vo：30 v、vf：50 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20 s；第二个交流电场参数vo：60 v、vf：60 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20 s；第三个直流电脉冲参数为直流脉冲电压600 v，作用时间50 μs，脉冲次数为1；最后一个交流电场参数vo：50v、vf：5 v，交流电场频率0.8 mhz，持续作用时间为7 s。电融合使用btx公司ecm2001+型融合仪。
12、本发明还提供上述基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法在制备杂交瘤细胞开发单克隆抗体领域中的应用。
13、本发明的有益效果是：
14、1、本发明提出了一种sa-biotin桥梁系统使脾细胞与sp2/0在融合前就间接结合的思路和方法，优化了融合策略及最大限度的获得目标融合子。
15、2、本发明总体大大减少了sp2/0-sp2/0、脾细胞-脾细胞的融合几率，提高了sp2/0-脾细胞的杂交瘤克隆形成率及后续筛选的阳性率。
16、3、本发明的电融合程序用于改良标记细胞，可使其在电场作用下形成充分排列的sp2/0-脾细胞交错的珍珠链状，增强异源细胞之间的接触面积，提高异源细胞的融合率。
1.一种基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法，其特征在于，步骤1）所述细胞悬液采用dpbs制备，悬液中细胞密度为1.0×107~2.5×107个/ml。
3.根据权利要求1所述的基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法，其特征在于，步骤1）中生物素标记反应采用sulfo-nhs-lc-biotin，sulfo-nhs-lc-biotin标记用量为35-70 μg/ml。
4.根据权利要求1所述的基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法，其特征在于，步骤2）中biotin标记脾细胞的悬液中链霉亲和素的标记用量为35-70 μg/ml；链霉亲和素与生物素的质量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法，其特征在于，步骤3）中biotin标记sp2/0骨髓瘤细胞与sa标记脾细胞混合的数量之比为1:(2-5)。
6.根据权利要求1所述的基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法，其特征在于，步骤3）中电融合仪设置参数包括三个交流电场、一个直流脉冲电压：第一个交流电场参数vo：30 v、vf：50 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20 s；第二个交流电场参数vo：60 v、vf：60 v，交流电场频率2 mhz，持续作用时间为20 s；第三个直流电脉冲参数为直流脉冲电压600 v，作用时间50 μs，脉冲次数为1；最后一个交流电场参数vo：50 v、vf：5 v，交流电场频率0.8 mhz，持续作用时间为7 s。
7.如权利要求1-6任一项所述基于sa-biotin桥梁的细胞标记改良电融合方法在制备杂交瘤细胞开发单克隆抗体领域中的应用。
