本发明属于致病性弓形杆菌检测，具体涉及一种用于检测食源性弓形杆菌的引物探针组合、试剂盒及用途。
背景技术：
1、食源性疾病是全球公共卫生领域面临的重大挑战之一，这些疾病通常由摄入被病原体污染的食物或水引起。随着人类饮食来源和方式的多样化，由食源性寄生虫病造成的食品安全问题日益突出。
2、弓形杆菌(arcobacter)是一种革兰氏阴性短杆菌，被认为是新发肠道病原菌和人畜共患菌，逐渐引起研究者的重视。弓形杆菌菌体大小为(0.2-0.9)×(0.5-3)μm，为革兰氏阴性、无芽孢、无荚膜的弯曲短杆菌，通常呈s形或螺旋形，长度可达到20μm。弓形杆菌过去被称为类弯曲菌(campylobacter-like)，是一种与campylobacter形态相似，亲缘很近的新型革兰氏阴性致病菌。目前已发现弓形杆菌有11个种，最常见的是布氏弓形杆菌(arcobacter butzleri)、嗜低温弓形杆菌(arcobacter cryaerophilus)和斯氏弓形杆菌(arcobacter skirrowii)，其与人类和动物疾病密切相关。弓形杆菌广泛分布于自然界，致病力与弯曲菌相当，并且比弯曲菌更易存活，引起许多研究者关注。
3、研究发现，弓形杆菌最重要的人类感染源是食品，该菌在牛、猪、火鸡、鹅等制品中均可检出，其中禽类被认为是最大的储存库。此外，该菌还大量存在于各种水体中，包括饮用水、湖泊水、地表水、地下水、污水等。弓形杆菌可通过水体媒介进入人体大肠，引发一系列的肠道疾病，危害人类和动物的健康。研究结果表明，弓形杆菌属是城市污水和城市污水化学生物絮凝池活性污泥中的优势菌群，且具有致病性。
4、弓形杆菌感染的主要症状为持续性腹泻，伴有腹痛、胃痉挛、恶心呕吐和发热等症状。食用了污染的食品或饮用污染的水是导致人感染弓形杆菌最常见的途径。因此，提前检测或在感染后通过检测实现快速精准治疗，是预防或应对弓形杆菌感染事件的有效措施。
5、传统的弓形杆菌的检测技术主要为分离培养，分离培养的方法需要经过增菌培养、分纯鉴定、生化检测等鉴定过程，存在操作繁琐、耗时较长且灵敏度不高的问题。随着分子生物学技术的不断发展，越来越多快速、特异性检测方法应运而生，其主要代表是聚合酶链式反应(pcr)。但是，普通pcr检测技术需要琼脂糖凝胶电泳确定扩增产物的大小，费时且易损害检测人员的健康。荧光定量pcr(quantitative pcr，qpcr)是一种应用广泛的分子诊断工具之一，所述方法通常采用荧光染料对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，不仅检测方法简单，且成本低。
6、在上述背景基础上，本发明提供一种基于荧光定量pcr的三重扩增体系，筛选得到特异性好，灵敏度高的引物探针组合用于布氏弓形杆菌(arcobacter butzleri)、嗜低温弓形杆菌(arcobacter cryaerophilus)和斯氏弓形杆菌(arcobacter skirrowii)的检测，在减少操作步骤和所需试剂的同时，提高检测效率和经济性，为食源性弓形杆菌相关疾病的快速诊断和预防提供强有力的工具。
技术实现思路
1、本发明的第一个目的时提供一种基于荧光定量pcr的用于检测食源性弓形杆菌的引物探针组合，所述引物和探针可以实现在同一个体系中对布氏弓形杆菌(arcobacterbutzleri)、嗜低温弓形杆菌(arcobacter cryaerophilus)和斯氏弓形杆菌(arcobacterskirrowii)进行特异性扩增和检测；本发明第二个目的是提供一种所述引物探针组合在制备用于检测食源性弓形杆菌的产品中的用途，具体的，本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒中包括如上所述的引物探针组合；本发明还有一个目的是提供一种针对食源性弓形杆菌的检测方法。
2、本发明包括如下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种用于检测食源性弓形杆菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合由1)-3)所示的上下游引物和探针组成：
4、1)用于检测布氏弓形杆菌的上下游引物如seq id no:10和seq id no:11所示，探针如seq id no:12所示；
5、2)用于检测嗜低温弓形杆菌的上下游引物如seq id no:13和seq id no:14所示，探针如seq id no:15所示；
6、3)用于检测斯氏弓形杆菌的上下游引物如seq id no:16和seq id no:17所示，探针如seq id no:18所示；
7、本发明所述的弓形杆菌为布氏弓形杆菌(arcobacter butzleri)、嗜低温弓形杆菌(arcobacter cryaerophilus)和斯氏弓形杆菌(arcobacter skirrowii)的组合。
8、进一步的，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，且所述探针的荧光报告信号互不干扰；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
9、本发明所述的“信号互不干扰”是指：上述各探针所用的荧光基团不同，且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用fam、hex、rox、cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，不同通道的信号不会互相干扰；另外，每一种荧光通道的三个信号可以通过加入不同的探针浓度进行荧光值的区分，从而形成不同的聚类信号，并通过聚类分析软件进行进一步的区分，不会相互干扰。
10、在本发明的具体实施方式中，用于检测所述三种食源性弓形杆菌的探针5’端标记的荧光报告基团分别选自fam、hex和rox。
11、第二方面，本发明提供一种本发明第一方面所述的引物探针组合在制备用于检测食源性弓形杆菌的产品中的用途。
12、所述用于检测食源性弓形杆菌的产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台。
13、第三方面，本发明提供一种用于检测食源性弓形杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物探针组合。
14、进一步的，所述试剂盒还包括酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、pcr缓冲液。
15、所述酶混合液中含有高保真taq酶、udg酶、镁离子、dntps中的至少一种。
16、本发明所述阴性质控品为经焦炭酸乙二脂(depc)处理的纯水。
17、本发明所述的阳性质控品为含有本发明所述的布氏弓形杆菌(arcobacterbutzleri)、嗜低温弓形杆菌(arcobacter cryaerophilus)和斯氏弓形杆菌(arcobacterskirrowii)的特定序列的质粒，所述特定序列为本发明技术人员知晓的。
18、第四方面，本发明提供一种不以疾病诊断和治疗为目的的检测食源性弓形杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：
19、(1)提取待测样本dna或rna；
20、(2)配置含有本发明第一方面所述的引物探针组合的pcr扩增体系进行pcr扩增反应；
21、(3)根据扩增曲线判断待测样本中是否存在相应的食源性弓形杆菌及所述食源性弓形杆菌的初始浓度。
22、在步骤(2)中所述的扩增体系中，上游引物的终浓度为0.1-0.2μm，下游引物的终浓度为0.2-0.3μm，探针的终浓度为0.1-0.15μm。
23、本发明所述的待测样本为任何可能含有食源性弓形杆菌的物质，包括但不限于食品、粪便、口腔拭子、肛拭子。
24、本发明提供的引物探针组合是基于实时荧光定量pcr技术，通过检测荧光信号的强弱实时检测pcr产物扩增量，对弓形杆菌，如布氏弓形杆菌(arcobacter butzleri)、嗜低温弓形杆菌(arcobacter cryaerophilus)和斯氏弓形杆菌(arcobacter skirrowii)同时进行检测和定量分析，并且检测灵敏度高。进一步的，本发明在三重pcr体系中首先剔除出现非特异性扩增和引物二聚体的引物组，再对灵敏度不高的引物进行优化，最终筛选得到选择特异性好，灵敏度高的引物对和探针。本发明提供的引物和探针组合可进一步制备成检测试剂盒用于食源性弓形杆菌的实时和快速检测。
1.一种用于检测食源性弓形杆菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合由1)-3)所示的上下游引物和探针组成：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，且所述探针的荧光报告信号互不干扰；所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，用于检测所述三种食源性弓形杆菌的探针5’端标记的荧光报告基团分别选自fam、hex和rox。
4.一种权利要求1-3任一项所述的引物探针组合在制备用于检测食源性弓形杆菌的产品中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用于检测食源性弓形杆菌的产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台。
6.一种用于检测食源性弓形杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、pcr缓冲液。
8.一种不以疾病诊断和治疗为目的的检测食源性弓形杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述的扩增体系中，上游引物的终浓度为0.1-0.2μm，下游引物的终浓度为0.2-0.3μm，探针的终浓度为0.1-0.15μm。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的待测样本为任何可能含有食源性弓形杆菌的物质，包括食品、粪便、口腔拭子、肛拭子。
