本发明属于半合成抗生素制备，尤其涉及一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法。
背景技术：
1、阿莫西林(amoxicillin)又称羟氨苄青霉素，是第二代青霉素的主要品种。其能够抑制细菌细胞壁的合成，是广谱半合成抗生素。因其具有高效、广谱抗菌作用，且毒副作用很小，世界卫生组织(who)推荐其为首选的β－内酰胺类口服抗生素。
2、阿莫西林的合成方法主要有化学合成法和酶催化合成法。化学法工艺比较成熟，但存在比较明显的缺点。首先，工艺路线长导致整体效率很低；其次，在生产过程中使用大量的有机溶剂，会产生较多的有毒有害废物，对环境造成较大污染；再者，反应在低温下进行，能源消耗与成本较高。相对于化学合成而言，在酶催化制备时，由于工艺条件温和，绿色环保，制备的阿莫西林质量优于化学合成法，故酶催化合成阿莫西林得到越来越多的研究与应用。酶催化合成阿莫西林当前主要由两步工艺组成，即先由水解用青霉素酰化酶(penicillin acylase,pa)催化青霉素(或青霉素盐)制备6-apa(6-氨基青霉烷酸)，再由合成用青霉素酰化酶催化6-apa与d-对羟基苯甘氨酸(或d-对羟基苯甘氨酸甲酯)反应合成阿莫西林(如申请号201711221286.6一种直通合成阿莫西林的方法；申请号201811490254.0一种酶法合成阿莫西林的方法)。但两步法工艺需要对中间产物进行分离，极大地增加了生产经济成本，且生产效率较低。当前已有报道利用水解用青霉素酰化酶与合成用青霉素酰化酶两种酶一锅法催化合成阿莫西林(wo 2022/195603)，但该方法需要两种酶协同作用才能获得较好的效果。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明创造了一种利用单酶一步由青霉素钾合成阿莫西林的方法。该方法具有催化速率快，产物收率高，纯水相反应体系绿色环保、成本低经济效益好等优势。
2、本发明是这样实现的，一种酶催化一步法由青霉素钾合成阿莫西林的方法，仅使用一种青霉素酰化酶突变体作为反应体系中的唯一一种酶，以青霉素或其盐(优选为青霉素钾)和d-对羟基苯甘氨酸甲酯为底物，在ph 4～8的缓冲体系中进行反应(优选ph 4～7)；所述青霉素酰化酶突变体的氨基酸序列与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，包含以下突变方式中的至少一种：f146αk、f24βr、f71βy、n241βk、g385βy或g385βr。
3、具体包括以下步骤：
4、s1：在反应瓶中加入ph 4～8的缓冲液作为反应缓冲体系；
5、s2：向反应缓冲体系中加入青霉素钾盐和d-对羟基苯甘氨酸甲酯，青霉素钾盐和d-对羟基苯甘氨酸甲酯的摩尔比为1:1～1:2，充分搅拌；
6、s3：向反应缓冲体系中加入固定化的青霉素酰化酶突变体，控制反应温度12～30℃，进行反应。优选反应温度为12～28℃。
7、进一步地，步骤s1中的缓冲液包括柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、pbs缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、纯水中的任一种。
8、进一步地，步骤s2中青霉素钾盐浓度为50～200mmol/l，d-对羟基苯甘氨酸甲酯浓度为50～400mmol/l。
9、进一步地，步骤s3中酶量为3000～30000u/l，反应时间1～6h。
10、进一步地，步骤s3后面还包括固定化的青霉素酰化酶突变体的回收步骤。
11、进一步地，固定化的青霉素酰化酶突变体的回收步骤包括：
12、s4：利用筛网滤出固定化的青霉素酰化酶；
13、s5：每10g固定化酶加入去离子水20～30ml，搅拌5～10min，抽干后重复清洗，至放出的水清澈透明且酶样无异味。
14、进一步地，步骤s5后面还包括s6：在缓冲液中加入0.5‰(质量体积比)的对羟基苯甲酸酯溶液，覆盖固定化酶，密封2～8℃保存。
15、进一步地，需要长期保存时，利用5‰戊二醛溶液将清洗干净的固定化的青霉素酰化酶突变体消毒，将酶滤出；在缓冲液中加入0.5‰(质量体积比)的对羟基苯甲酸酯溶液，覆盖固定化酶，密封2～8℃保存。
16、综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明利用嗜柠檬酸克鲁维氏菌(kluyvera citrophila)青霉素酰化酶的突变体作为反应体系中的唯一酶，以青霉素钾盐和d-对羟基苯甘氨酸甲酯为底物，实现阿莫西林一步合成，产物收率最高可达100％。该方法具有催化速率快，产物收率高，纯水相反应体系绿色环保、成本低经济效益好等优势。
1.一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于：仅使用一种青霉素酰化酶突变体作为反应体系中的唯一一种酶，以青霉素或其盐与d-对羟基苯甘氨酸甲酯为底物，在ph 4～8的缓冲体系中进行反应；所述青霉素酰化酶突变体的氨基酸序列与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，包含以下突变方式中的至少一种：f146αk、f24βr、f71βy、n241βk、g385βy或g385βr。
2.根据权利要求1所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于：步骤s1中的缓冲液包括柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、pbs缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、纯水中的任一种。
4.根据权利要求2所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于：步骤s2中青霉素钾盐浓度为50～200mmol/l，d-对羟基苯甘氨酸甲酯浓度为50～400mmol/l。
5.根据权利要求2所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于：步骤s3中酶量为3000～30000u/l，反应时间1～6h。
6.根据权利要求2所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于：步骤s3后面还包括固定化的青霉素酰化酶突变体的回收步骤。
7.根据权利要求6所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于，所述固定化的青霉素酰化酶突变体的回收步骤包括：
8.根据权利要求7所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于：步骤s5后面还包括s6：在所述缓冲液中加入0.5‰的对羟基苯甲酸酯溶液，覆盖固定化酶，密封2～8℃保存。
9.根据权利要求7所述的一种酶催化一步法由青霉素或其盐合成阿莫西林的方法，其特征在于：步骤s5后面还包括s6：利用5‰戊二醛溶液将清洗干净的固定化的青霉素酰化酶突变体消毒，将酶滤出；在所述缓冲液中加入0.5‰的对羟基苯甲酸酯溶液，覆盖固定化酶，密封2～8℃保存。
