钙离子螯合剂在制备用于提高血管内皮细胞吞噬能力的制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于治疗心脑血管疾病药物技术领域，具体涉及一种钙离子螯合剂在制备用于提高血管内皮细胞吞噬能力的制剂中的应用。


背景技术：

2.心脑血管疾病严重危害人类健康，动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)被认为是心血管疾病的主要病理基础。大量研究表明，动脉粥样硬化病变好发于血管血流扰动的特定区域，比如血管分支狭窄和弯曲等形成反向流，震荡流，湍流等区域。在血管腔内，内皮细胞与血流直接接触，具有感知血流切应力变化的能力。动脉粥样硬化病灶处的扰动流区域由于流场改变导致细胞碎片、纳米物质、细菌等堆积于靠近血管内壁的区域，并且血管内皮细胞可通过不依赖于特定蛋白受体的吞噬作用去吞噬这些物质。目前，有关内皮细胞吞噬和动脉粥样硬化的发生发展还处于研究阶段。
3.目前，没有相关文献报道对于促进血管内皮细胞吞噬或通过促进血管内皮细胞吞噬治疗动脉粥样硬化的相关物质。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明目的在于提供一种钙离子螯合剂在制备用于提高血管内皮细胞吞噬能力的制剂中的应用。
5.进一步，所述钙离子螯合剂选自乙二胺四乙酸及其衍生物、乙二醇双(2氨基乙醚)四乙酸及其衍生物、1,2双(2氨基苯氧基)乙烷n,n,n
′n′
四乙酸及其衍生物中一种或多种混合。
6.进一步，钙离子螯合剂也可在其他钙环境的内皮细胞起到相同的作用。
7.本发明目的在于还提供一种钙离子螯合剂在制备用于治疗动脉粥样硬化的制剂中的应用。
8.进一步，所述钙离子螯合剂选自乙二胺四乙酸及其衍生物、乙二醇双(2氨基乙醚)四乙酸及其衍生物、1,2双(2氨基苯氧基)乙烷n,n,n
′n′
四乙酸及其衍生物中一种或多种混合。
9.具体地，当纳米药物进入血管后会经内皮进行给药，内皮细胞吞噬是异常切应力促动脉粥样硬化的新机制。因此，深入探讨在低振荡流情况下，内皮细胞吞噬对影响动脉粥样硬化的形成和发展的分子机制，将为动脉粥样硬化的有效防治提供新的靶点及临床策略。用钙离子螯合剂将内皮细胞周围或者内皮细胞中的钙部分去除或者完全去除，有效提高内皮细胞对纳米药物的吞噬能力。
10.本发明目的在于还提供一种钙离子螯合剂在制备用于促进血管内皮细胞对药物吸收的制剂中的应用。
11.进一步，所述钙离子螯合剂选自乙二胺四乙酸及其衍生物、乙二醇双(2氨基乙醚)
四乙酸及其衍生物、1,2双(2氨基苯氧基)乙烷n,n,n
′n′
四乙酸及其衍生物中一种或多种混合。
12.进一步，所述药物包括胞外囊泡，外泌体，人工囊泡，有机纳米药物颗粒，无机纳米药物颗粒中的一种或多种混合。
13.具体地，钙离子螯合剂快速螯合掉血管内皮的钙离子后，同时纳米药物或者是生物囊泡药物，内皮细胞的吞噬急剧增加。
14.在某些具体实施例中，所述钙离子螯合剂的浓度选择0.5-1.5mm，优选为1mm。更优选地，所述钙离子螯合剂与所述药物的质量比为0.5-1:0.5-1。
15.在某些具体实施例中，通过尾静脉注射的方式将钙离子螯合剂给药于c57bl/6小鼠，检测发现当钙离子螯合剂将内皮细胞内钙离子耗竭后，即在钙缺乏环境下，内皮细胞的吞噬红细胞胞外囊泡rbcevs增强，明确了钙螯合剂能通过减少胞内钙使内皮细胞膜的流动性增加，从而促进内皮细胞吞噬rbcevs，并进一步提高红细胞胞外囊泡rbcevs利用度。
16.本发明目的在于还提供一种提高内皮给药药物利用度的方法，其特征在于，将所述内皮给药药物与钙离子螯合剂联合使用，所述内皮给药药物包括：胞外囊泡，外泌体，人工囊泡，有机纳米药物颗粒或无机纳米药物颗粒中的一种或多种混合。
17.进一步，所述钙离子螯合剂选自乙二胺四乙酸及其衍生物、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸及其衍生物、1,2双(2-氨基苯氧基)乙烷n,n,n
′n′
四乙酸及其衍生物中一种或多种混合。本发明有益效果在于
18.通过本发明实施例得知，与现有技术相比，本发明通过细胞和动物实验水平，明确了钙离子螯合剂能使内皮细胞膜黏度下降，提高内皮细胞膜的流动性，从而促进其对纳米药物的吞噬，即能显著提高纳米药物利用度。
附图说明
19.图1为钙离子螯合剂和氯化钙分别对内皮细胞吞噬rbcevs的影响en face染色情况(比例尺＝20μm)。
20.图2为钙离子螯合剂和氯化钙分别对内皮细胞吞噬rbcevs的影响数据统计情况(n＝5，*为p《0.05或***为p《0.001)。
21.图3为小鼠尾静脉分别注射氯化钙和钙螯合剂对左颈动脉lca和右颈动脉rca内皮细胞吞噬rbcevs的影响en face染色情况(比例尺＝10μm)。
22.图4为小鼠尾静脉分别注射氯化钙和钙螯合剂对左颈动脉lca和右颈动脉rca内皮细胞吞噬rbcevs的影响数据统计情况(n＝5，**为p《0.01或***为p《0.001)。
23.图5为钙离子处理下不同细胞粘度((n＝3，*为p《0.05或**为p《0.01，***p《0.001)。
24.图6为钙离子螯合剂处理下不同细胞粘度(n＝3，*为p《0.05或**为p《0.01，***为p《0.001)。
25.图7为不同浓度baptaam对内皮细胞存活率的影响(n＝3)。
具体实施方式
26.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
27.实施例1细胞实验
28.本发明实施例中，细胞培养基均为普通培养基，不额外加入钙离子或钙离子螯合剂。
29.本发明实施例中，将内皮细胞接种于细胞孔板里，待细胞长满后，先用钙离子螯合剂预处理细胞30分钟，然后用新鲜细胞培养基洗涤细胞至少3次，bapta-am处理细胞时需先溶于10％dmso，然后再溶于90％的生理盐水(含20％sbe-β-cd)；氯化钙处理细胞的浓度为10μg/ml。结果如图1和图2所示，用氯化钙和钙离子螯合剂baptaam分别处理内皮细胞，氯化钙抑制了内皮细胞吞噬红细胞胞外囊泡rbcevs，而baptaam促进了内皮细胞对红细胞胞外囊泡的吞噬。
30.实施例2动物实验
31.本发明实施例中，baptaam注射小鼠时，需先溶于10％dmso，然后再溶于90％的生理盐水(含20％sbeβcd)。
32.本发明实施例中，氯化钙注射液注射小鼠的浓度为10μg/ml，注射时需缓慢进药，否则容易引起小鼠低血压或心律失常。
33.本发明实施例中，选择体重为15-20g的6周龄雄性c57bl/6小鼠15只，对其进行颈动脉结扎手术，构建小鼠oss颈动脉结扎模型。结扎的具体步骤如下：
34.(1)将小鼠麻醉后，仰卧固定在手术台上，从气管正上方剪开皮肤，对气管左右侧的肌肉分别进行分离；首先用镊子沿着左侧气管逐层剥离肌肉，找到左侧颈动脉鞘，然后用镊子小心分离靠近左颈动脉的筋膜和与迷走神经，分离出左颈总动脉(lca)；沿着颈总动脉向上继续剥离，需找到颈外动脉(eca)，颈内动脉(ica)，枕动脉(oa)和甲状腺上动脉(sta)。
35.(2)用90医用缝合线结扎除sta以外的三个分支血管(eca，ica和oa)，并保证sta血流畅通。
36.(3)在右颈总动脉(rca)进行分离并找到4个分支血管，但不进行结扎，作为对照组。
37.(4)用50缝合线逐层缝合，缝合后用碘伏擦拭伤口，并将小鼠置于37℃恒温板上，等待苏醒转入对应的鼠笼。
38.本发明实施例中，构建的oss模型中，lca的血流为oss，而rca处的血流为nss。通过en face染色和数据统计的结果图3和图4所示，可以看出，与rca组相比，lca组有明显的rbcevs红色荧光信号与内皮细胞共定位；经小鼠尾静脉注射氯化钙时(lca ca
2
)，lca ca
2
组的rbcevs红色荧光信号明显低于lca组，即氯化钙抑制了lca组的内皮细胞吞噬；相反，当注射baptaam后(lca baptaam)，rbcevs红色荧光信号明显强于lca组。即小鼠尾静脉分别注射氯化钙和钙螯合剂baptaam，baptaam明显促进了右颈动脉结扎oss区域血管内皮细胞对红细胞胞外囊泡rbcevs的吞噬。
39.该结果与实施例1的细胞结果一致，baptaam能抑制血液中钙离子浓度，促进内皮细胞吞噬rbcevs，提高rbcevs的利用度。
40.实施例3dph探针检测内皮细胞膜流动性
41.使用dph探针检测内皮细胞膜流动性，具体步骤如下：
42.(1)工作液的配制：按使用说明书用试剂盒中稀释液将dph探针稀释，稀释范围根据实验需求，最多可稀释至10000倍，配制成dph染色工作液。
43.(2)将内皮细胞接种至12孔板，在显微镜下观察细胞长满后可以进行染色处理，用移液枪吸走培养基，加入染色工作液，在细胞培养箱孵育至少0.5小时。
44.(3)用ph 7.4hbss或20mm hepes或pbs洗涤细胞1次后重悬。
45.(4)用带偏正光的分光光度计对细胞进行检测。设置参数为：激发波长＝355nm，发射波长＝430nm。
46.按下列公式计算荧光偏振度p：p＝(ivv-givhihv)/(ivv givh)，其中，校正因子g＝ihv/ihh，式中：ivv:起偏和检偏器光轴同为垂直方向时测得的荧光强度；ivh:起偏和检偏器光轴分别为垂直和水平方向时测得的荧光强度；ihv:起偏和检偏器光轴分别为水平和垂直方向时测得的荧光强度；ihh:起偏和检偏器光轴同为水平方向时测得的荧光强度；p能反映膜脂区域的粘度(η)，而η与膜流动性成反比。
47.结果如图5和图6所示，dph探针检测baptaam使内皮细胞膜黏度下降，提高内皮细胞膜的流动性，从而促进其对rbcevs的吞噬，而氯化钙则相反。
48.实施例4细胞毒性试验
49.通过mts实验对不同浓度baptaam对内皮细胞存活率的影响进行研究，按baptaam建议浓度和时间(1mm，30分钟)对细胞进行试验，实验步骤如下：
50.(1)培养huvec细胞至对数生长期。
51.(2)取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1
×
104～2
×
104上述细胞之一的1640培养液(加10％小牛血清)。
52.(3)每孔加20μl mts，继续培养3～4小时显色。
53.(4)检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm(或490nm，或570nm和690nm)处检测各孔的光吸收值(od)。用样品稀释度对od值(od570、od490或od570/od690)绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。
54.结果如图7所示，按baptaam建议浓度和时间(1mm，30分钟)对细胞无显著毒性，具有较好安全性。
55.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。