本发明属于饮用水水质微生物检测，尤其涉及一种饮用水氯化消毒后水中中间状态损伤细菌的识别方法及其应用。
背景技术：
1、微生物质量是饮用水国家标准对水质卫生安全要求的首要内容。控制微生物污染对保障饮用水安全至关重要，也是城镇供水企业的重要工作任务。菌落总数是供水企业和水质监督管理部门检测饮用水微生物数量的主要方法。其基本原理是：水样在营养琼脂培养基上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数。然而，氯化消毒作为饮用水处理厂保障微生物安全的主要工艺途径，在对微生物细胞造成损伤的同时，也容易诱导它们暂时进入存活但不可培养状态，并因此逃避培养法的监测，造成对消毒效率和饮用水微生物安全的高估。
2、为了更准确评估饮用水消毒效率和微生物质量，科研工作者在近二十年来已逐渐开发出另一种不依赖于培养性的微生物计数方法—流式细胞术(fcm)作为hpc的替代方法。fcm完整细胞计数(icc)根据细胞膜的完整性(而非可培养性)来区分活菌和死菌，为微生物监测提供了一种快速、准确且可重复的技术。然而，在fcm-icc中，人们尚未充分了解氯化消毒对水中膜受损细菌的潜在生存能力的影响。作为一种强氧化剂，氯作用于细胞壁和细胞膜，攻击脂质双分子层的双键和膜蛋白的氨基酸，导致膜完整性丧失和细胞内部成分泄漏。此外，由于次氯酸(hclo)分子小且不带电荷，因此很容易扩散到细胞内，并迅速与蛋白质和dna的亲核结构发生反应，导致蛋白质错误折叠和dna链断裂。受损伤但有活力的细菌一般不包括在fcm-icc中，因为大多数研究人员认为损伤(尤其是细胞膜损伤)是细菌活力丧失的可靠指标。但事实上，认为饮用水中所有膜损伤的细菌都已丧失活力可能是不合理的，因为细菌是否被完全灭活应取决于损伤的程度。由于氯化消毒副产物的形成，水厂必须限制氯的用量，饮用水中一些损伤细菌可能以“中间状态”在非致死剂量的氯消毒剂下存活，但目前很少研究者在fcm分析中关注这些有潜在活性的损伤细菌。
3、在饮用水输配水系统(dwds)中，中间状态损伤细菌可能会以生物膜的形式附着在管壁上，从而有足够的时间修复受伤的细胞结构，如细胞膜和dna，然后重新获得繁殖能力。同样，二次供水设施也为损伤细菌的复苏提供了较长的滞留时间，最终导致用户自来水中微生物检出率超标。然而，在饮用水的微生物数量检测中，人们很少关注氯消毒后受损细菌的存在，它们对dwds中微生物再生的潜在贡献也被严重忽视。
4、目前基于流式细胞术对饮用水中细菌进行检测时，在检测数据的设门分析中，研究者通常将细菌分为活性细菌和非活性细菌两类。将所有膜受损细菌划分到非活性细菌中，忽视了一些受损细菌在饮用水输配水系统中的复苏能力，从而高估了饮用水的氯消毒效率。余辉等(微生物学通报，2012，39(08)：1171-1178)在饮用水微生物的安全快速检测一文中提到了流式细胞术区分饮用水中的活性细菌和非活性细菌的方法。刘倩等(工业水处理，2022，42(05)：163-168)在流式细胞术检测水中细菌总数的方法研究一文中利用sybrgreen和dapi检测活菌和死亡的菌体。目前的研究均未涉及到对饮用水中受损细菌的检测。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于提供一种饮用水氯化消毒后水中中间状态损伤细菌的识别方法，所述识别方法包括以下步骤：
2、(1)采集氯化消毒后的饮用水样本；
3、(2)将饮用水样本转移至流式细胞仪进样管中，按饮用水样本与sybr green i染色剂、7-aad染色剂体积比ml：μl：μl为0.5-1.5：5-15：0.5-1.5，加入sybr green i染色剂和7-aad染色剂，震荡后36-38℃下避光孵育10-20min；所述sybr green i染色剂的浓度为80-120x，7-aad染色剂的浓度为8-12mm；
4、(3)将孵育后的流式细胞仪进样管转移至分析型流式细胞仪中，开始进样，488nm蓝色激光器激发荧光，fitc-a通道检测绿色荧光信号，pc5.5-a通道检测红色荧光信号，根据细菌细胞群分布特征，手动门控将其划分为三个类群，完整细胞群、中间状态损伤细菌、完全失活细胞群。
5、优选地，所述步骤(1)中的饮用水样本包括水厂消毒后水样或管网水。
6、更优选地，所述步骤(2)中sybr green i染色剂的浓度为100x。
7、更优选地，所述步骤(2)中7-aad染色剂的浓度为10mm。
8、更优选地，所述步骤(2)中sybr green i染色剂的加入量为10μl/1000μl饮用水样本，7-aad染色剂的加入量为1μl/1000μl饮用水样本。
9、更优选地，所述步骤(3)中流式细胞仪的激发光源选取488nm蓝色激光器，进样速度为中速；检测时，sybr green i染色细胞在525nm绿色荧光fitc-a通道下检测，7-aad染色细胞在690nm红色荧光pc5.5-a通道下检测。
10、更优选地，所述步骤(3)中流式细胞仪的采集参数设置，阈值中fsc设置为5000，ssc设置为5000。
11、更优选地，所述步骤(3)中手动门控分析步骤为：
12、(a)在fitc-a/pc5.5-a散点图中选定fitc-a通道荧光强度<103处以及pc5.5-a通道荧光强度<103处的散点聚团为杂质聚团；
13、(b)fitc-a通道荧光强度>103处以及pc5.5-a通道荧光强度>103处分别另有散点聚团，由于sybr green i在fitc-a通道处荧光较强，可以与所有的细菌细胞染色，而7-aad染料是在pc5.5-a通道处荧光较强，它只能与完全失活细胞结合，遮盖sybr green i的染色，故左上方区域为完全失活细胞区，右下方区域为活细胞区。圈定位于右下方的区域为完整细胞群，位于左上方的区域为完全失活细胞群；
14、(c)在完整细胞群和完全失活细胞群的中间位置另有散点聚团，圈定为中间状态细胞群，中间状态细胞群具有比完整细胞更弱的fitc-a通道荧光强度和更强的pc5.5-a通道荧光强度，pc5.5-a通道荧光强度又弱于完全失活的细胞群；
15、(d)圈定的中间状态细胞群即为饮用水氯化消毒后水中的中间状态损伤细菌。
16、本发明的目的之二在于提供上述识别方法在水质微生物检测领域中的应用。
17、本发明针对当前饮用水净化消毒工艺过程中，需要控制氯的投加剂量以减少有害的消毒副产物形成，导致了饮用水中存活损伤细菌的发生，这部分细菌容易逃避常规的饮用水微生物监测方法，并且其中的病原体可能在饮用水分配系统完成细胞修复与复苏，研发了一种针对饮用水中中间状态损伤细菌的识别方法。该方法以流式细胞术的中间状态细胞群为目标，提出了存活损伤细菌在饮用水细菌中的识别特征。
18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19、本发明首次在流式细胞术设门分析中将细菌分为完整细胞群、中间状态细胞群和完全失活细胞群，其中中间状态细胞群是存活受损细菌。通过对受损细菌的检测，可以更客观地评价饮用水的氯消毒效率。饮用水氯化消毒后水中中间状态损伤细菌的识别方法有助于客观反映氯化消毒对水中微生物的灭活效果和消毒效率，对完善当前消毒工艺，提高供水水质具有重要作用。此外，通过识别中间状态受损细菌，还可以更好地了解这些细菌在饮用水输配系统中的修复和复苏过程，加强供水末端水质管理，减少健康风险。
1.一种饮用水氯化消毒后水中中间状态损伤细菌的识别方法，其特征在于，所述识别方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的识别方法，其特征在于，所述步骤(1)中的饮用水样本包括水厂消毒后水样或管网水。
3.根据权利要求2所述的识别方法，其特征在于，所述步骤(2)中sybr green i染色剂的浓度为100x。
4.根据权利要求3所述的识别方法，其特征在于，所述步骤(2)中7-aad染色剂的浓度为10mm。
5.根据权利要求4所述的识别方法，其特征在于，所述步骤(2)中sybr green i染色剂的加入量为10μl/1000μl饮用水样本，7-aad染色剂的加入量为1μl/1000μl饮用水样本。
6.根据权利要求5所述的识别方法，其特征在于，所述步骤(3)中流式细胞仪的激发光源选取488nm蓝色激光器，进样速度为中速；检测时，sybr green i染色细胞在525nm绿色荧光fitc-a通道下检测，7-aad染色细胞在690nm红色荧光pc5.5-a通道下检测。
7.根据权利要求6所述的识别方法，其特征在于，所述步骤(3)中流式细胞仪的采集参数设置，阈值中fsc设置为5000，ssc设置为5000。
8.根据权利要求1-7任一项所述的识别方法，其特征在于，所述步骤(3)中手动门控分析步骤为：
9.权利要求1-7任一项所述的识别方法在水质微生物检测领域中的应用。
10.权利要求8所述的识别方法在水质微生物检测领域中的应用。
