本发明涉及基因工程及畜牧学遗传育种领域，特别是涉及一种sgrna及将外源基因无缝嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码后的方法和应用。
背景技术：
1、利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白具有以下优点：首先是动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性；其次是动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀得到乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。基于上述优点，动物乳腺生物反应器具有广泛的应用前景。由于奶山羊饲养成本低，产奶量高，常用来制备乳腺生物反应器。
2、对于乳腺生物反应器来说，外源蛋白在乳腺中的表达水平是决定乳腺生物反应器价值的关键。外源蛋白要在乳腺中获得稳定高表达，乳腺特异性强启动子是必须的，其次是外源基因整合的位点。山羊乳蛋白中约75％为酪蛋白，而β酪蛋白占所有酪蛋白的比例将近50％，β酪蛋白基因(casein beta，csn2)在泌乳激素的刺激下具有很强的表达活性，在乳蛋白的表达过程中处于绝对优势地位，表明山羊β酪蛋白基因启动子是乳腺特异性的强启动子，目前已有利用β酪蛋白基因启动子实现外源基因高效表达并分泌到乳汁中的报道。另外也有研究初步证实该基因5’调控区和3’调控区、内含子1、外显子2等区域均对基因表达具有调控作用，但研究结果基本上来源于体外细胞水平的比较，且多数只是序列区段间进行了一些比较，对于该基因在体内表达的精细调控仍然不太清楚，使得利用β酪蛋白内源启动子表达外源基因具有较大的不确定性。在此背景下要实现外源基因高水平的乳腺特异性表达，在利用β酪蛋白基因内源启动子时，尽量少改变可能含有调控元件的序列是选择外源基因嵌入位点的一种稳妥的策略。
3、现有技术中利用β酪蛋白基因内源启动子表达外源基因的策略，多将外源基因嵌入对β酪蛋白基因启动子活性有调控作用的内含1或外显子2中，这些技术方法或改变了内含子1序列，或破坏了信号肽前的外显子2序列，或破坏了信号肽序列，可能影响到外源基因乳腺特异性高效分泌表达。本发明拟设计一条特殊的sgrna，在该sgrna和cas9作用下外源基因以同源臂介导的末端接合方式精准嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后，不改变信号肽及其上游的任何一个碱基，同时实现β酪蛋白信号肽编码序列与外源基因之间精准无缝连接，以期更好地实现外源基因高效表达与分泌。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种sgrna及将外源基因无缝嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码后的方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供了一条高效编辑山羊β酪蛋白基因的sgrna，在该sgrna和cas9作用下外源基因以同源臂介导的末端接合方式精准嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后，不改变信号肽及其上游的任何一个碱基，同时实现β酪蛋白信号肽编码序列与外源基因之间精准无缝连接，以期更好地实现外源基因高效表达与分泌。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供了一种高效编辑山羊β酪蛋白基因的sgrna1，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.8所示。
4、本发明提供了编码上述的sgrna1的dna，所述dna的核苷酸序列如seq id no.10所示。
5、本发明提供了一种含有上述的dna的表达载体或表达盒。
6、本发明提供了一种打靶载体，所述打靶载体包括依次连接的sgrna1识别序列、上游同源臂、外源基因表达盒、下游同源臂和sgrna1识别序列；
7、所述sgrna1识别序列的核苷酸序列如seq id no.19所示；所述上游同源臂的核苷酸序列如seq id no.20所示；所述下游同源臂的核苷酸序列如seq id no.24所示；所述外源基因表达盒为第1个外源基因表达盒启动子缺失且起始密码子第1个碱基缺失的基因表达盒。
8、本发明提供了一种打靶组合物，包括sgrna系统、cas9系统和上述的打靶载体，所述sgrna系统包括上述的sgrna1；所述cas9系统包含cas9 mrna或者cas9蛋白。
9、本发明提供了上述的sgrna1、上述的dna、上述的表达载体或表达盒、上述的打靶载体或上述的打靶组合物在如下(1)-(5)中任意一项或几项中的应用：
10、(1)在特异性识别和/或靶向山羊β酪蛋白基因中的应用；
11、(2)在山羊β酪蛋白基因中定点整合外源基因中的应用；
12、(3)在制备山羊β酪蛋白基因中定点整合外源基因的细胞系中的应用；
13、(4)在制备转基因山羊中的应用；
14、(5)在山羊分子育种中的应用。
15、本发明提供了一种将外源基因精准无缝嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后的方法，所述方法包括方法一和方法二；
16、所述方法一包括以下步骤：上述的sgrna1、cas9和上述的打靶载体的混合物导入山羊胚胎中，在胚胎发育的适当阶段移植到受体母羊中，在出生的羔羊中鉴定外源基因精准嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后的山羊个体；所述cas9为cas9 mrna或者cas9蛋白；
17、所述方法二包括以下步骤：将表达上述的sgrna1和cas9的表达载体和上述的打靶载体导入山羊细胞中，筛选外源基因精准无缝嵌入山羊细胞基因组β酪蛋白信号肽编码序列后的单克隆细胞，通过体细胞核移植和胚胎移植得到外源基因精准嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后的山羊个体。
18、优选的，所述方法一中，所述混合物中sgrna1的终浓度为50ng/μl，cas9的终浓度为100ng/μl，打靶载体的终浓度为50-200ng/μl。
19、本领域技术人员应该理解，根据不同动物casein beta基因的保守性和同源性，在其它动物的casein beta基因中，通过同源比对获得的与如sgrna1相同功能的sgrna及其表达载体、以及上述sgrna及其表达载体在外源基因精准无缝嵌入动物基因组β酪蛋白信号肽编码序列后的应用也在本发明保护范围内。
20、进一步优选的，所述方法一包括以下步骤：
21、(1)合成或者体外转录制备上述的sgrna1；
22、(2)体外转录制备cas9 mrna；
23、(3)构建打靶载体，步骤为：
24、靶向山羊casein beta基因第2外显子58与59nt之间的打靶载体(targetvector)：优选合成或者pcr扩增山羊casein beta基因第2外显子58nt至上游共800bp序列作为5’同源臂(上游同源臂，ha-l，其核苷酸序列如seq id no.20所示)，第1个外源基因表达盒为启动子缺失且起始密码子第1个碱基缺失的基因表达盒，无缝融合到5’同源臂末端，第2个完整的外源基因表达盒紧随第1个外源基因表达盒之后，合成或者pcr扩增山羊casein beta基因第2外显子59nt至下游共824bp序列作为3’同源臂(下游同源臂，ha-r，其核苷酸序列如seq id no.24所示)，融合到最后1个外源基因表达盒后，在合成或pcr扩增同源臂时ha-l的5’端和ha-r的3’端分别加入sgrna1识别序列，将上述片段依次构建到克隆载体中；所述sgrna1识别序列的核苷酸序列如seq id no.19所示；所述克隆载体为pbluescript ii ks+；
25、(4)将sgrna1与cas9(蛋白或mrna)和打靶载体混合，得到混合物，sgrna1的终浓度分别为50ng/μl，cas9的终浓度为100ng/μl和打靶载体的终浓度为50-200ng/μl；
26、(5)将所述混合物导入山羊胚胎，培养至囊胚进行鉴定，或者在胚胎发育的适当阶段移植到同期发情处理的受体母羊中，在出生的羔羊中鉴定外源基因精准嵌入β酪蛋白信号肽编码序列后的个体。
27、进一步优选的，所述方法二包括以下步骤：
28、(1)以表达cas9蛋白的质粒为基础构建sgrna1表达载体；所述表达cas9蛋白的质粒优选包括px330或px458，但不限于px330和px458；
29、(2)构建打靶载体，步骤为：
30、靶向山羊casein beta基因第2外显子58与59nt之间的打靶载体(targetvector)：优选合成或者pcr扩增山羊casein beta基因第2外显子58nt至上游共800bp序列作为5’同源臂(上游同源臂，ha-l，其核苷酸序列如seq id no.20所示)，第1个外源基因表达盒为启动子缺失且起始密码子第1个碱基缺失的基因表达盒，无缝融合到5’同源臂末端，第2个完整的外源基因表达盒紧随第1个外源基因表达盒之后，合成或者pcr扩增山羊casein beta基因第2外显子59nt至下游共824bp序列作为3’同源臂(下游同源臂，ha-r，其核苷酸序列如seq id no.24所示)，融合到最后1个外源基因表达盒后，在合成或pcr扩增同源臂时ha-l的5’端和ha-r的3’端分别加入sgrna1识别序列，将上述片段依次构建到克隆载体中；所述sgrna1识别序列的核苷酸序列如seq id no.19所示；所述克隆载体为pbluescript ii ks+；
31、(3)将上述的sgrna1表达载体和打靶载体共转山羊细胞，筛选单克隆细胞，得到外源基因精准嵌入β酪蛋白信号肽编码序列后的山羊细胞，通过体细胞核移植和胚胎移植得到外源基因精准嵌入β酪蛋白信号肽编码序列后的山羊个体；所述共转的方式包括电转或脂质体介导转染。
32、本发明公开了以下技术效果：
33、1、外源基因靶向整合效率高
34、体外切割试验表明，本发明提供的sgrna1在cas9蛋白作用下，能够高效切割靶dna的靶位点，几乎可以达到100％的效率；在sgrna1和cas9作用下外源基因以同源臂介导的末端接合方式靶向sgrna1位点整合效率10-20％，降低了外源基因打靶山羊的制备成本。
35、2、外源基因无缝嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后，减少对潜在调控元件的破坏
36、本发明将外源基因精准高效嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后，不改变信号肽及其上游的任何一个碱基，同时实现β酪蛋白信号肽编码序列与外源基因之间精准无缝连接，减少以往外源基因插入β酪蛋白内含子1或外显子2对潜在表达调控元件的破坏，有利于实现外源基因高效表达与分泌，用于乳腺生物反应器山羊的制备。而且，本发明还能够用于山羊的育种，将有益外源基因无缝嵌入到β酪蛋白信号肽编码序列后，实现外源基因的表达与分泌，进而获得转基因动物，为转基因动物的获得提供了新的途径。
1.一种高效编辑山羊β酪蛋白基因的sgrna1，其特征在于，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.8所示。
2.编码权利要求1所述的sgrna1的dna，其特征在于，所述dna的核苷酸序列如seq idno.10所示。
3.一种含有权利要求2所述的dna的表达载体或表达盒。
4.一种打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包括依次连接的sgrna1识别序列、上游同源臂、外源基因表达盒、下游同源臂和sgrna1识别序列；
5.一种打靶组合物，其特征在于，包括sgrna系统、cas9系统和权利要求4所述的打靶载体，所述sgrna系统包括权利要求1所述的sgrna1；所述cas9系统包含cas9 mrna或者cas9蛋白。
6.权利要求1所述的sgrna1、权利要求2所述的dna、权利要求3所述的表达载体或表达盒、权利要求4所述的打靶载体或权利要求5所述的打靶组合物在如下(1)-(5)中任意一项或几项中的应用：
7.一种将外源基因精准无缝嵌入山羊基因组β酪蛋白信号肽编码序列后的方法，其特征在于，所述方法包括方法一和方法二；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法一中，所述混合物中sgrna1的终浓度为50ng/μl，cas9的终浓度为100ng/μl，打靶载体的终浓度为50-200ng/μl。
