本发明涉及细胞培养领域，具体涉及神经母细胞瘤类器官构建配方，还涉及由该配方培养神经母细胞瘤类器官的方法。
背景技术：
1、神经母细胞瘤是现阶段儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤，发病隐匿，恶性程度高，病情进展迅速，早期即可发生远处转移，高危患儿5年生存率仅50％，病死率达儿童恶性肿瘤的15％。中、低危患儿以手术切除联合术后化疗为主，高危组患儿采用包括诱导期(联合化疗及手术切除)、巩固期(自体造血干细胞移植及放疗)、维持期(维甲酸、化疗等)三个阶段多学科联合治疗(mdt)方式。无论患儿病情进展至那个阶段，都需要联合化疗手段进行干预。至此，选择最适合患者个体的化疗药物是术后治疗关键的一环。
2、临床上，常利用小鼠建立人源性组织异种移植(patient-derivedxenografts，pdx)模型，即将来自患者的肿瘤组织移植到重症免疫缺陷型小鼠的体内生长形成移植瘤，待其生长至一定大小时，将其取出再移植至扩至新的一批小鼠内，重复操作至更多代数，直至满足药物筛选与药效评价的用量。pdx模型可以保留亲代肿瘤生长性状，维持异质性，但耗资高，耗时长，成功率低是其不可避免的缺点，对于病情发展迅速的神经母细胞瘤患儿而言，寻找一种快速有效的药物筛选与药效评价模型刻不容缓。
3、2009年，hans clevers从lgr5+的小肠干细胞中培养出了小肠类器官，被认为是“类器官元年”，随着类器官领域的不断深入发展，不同于2d细胞培养技术，3d类器官模型技术可以更进一步实现成功率更高的从肿瘤组织个性化的模型。肿瘤类器官保留了母体肿瘤的关键组织病理学、遗传和表型特征，赋予其与母体一致的化疗药物及靶向药物的敏感性，从而实现个性化用药方案的筛选。
4、肿瘤类器官作为“试药替身”，不仅可以为临床患者进行个性化的药物筛选，还为科研工作者提供更丰富的体外模拟肿瘤异质性及肿瘤微环境相互作用的代表性平台，为早日攻克癌症难题，奠定基础。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种神经母细胞瘤类器官构建配方；本发明的目的之二在于提供利用所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、1、一种神经母细胞瘤类器官构建配方，所述配方包括样本培养基，所述样本培养基各组分浓度如下：在advaced dmem/f12中加入1-5％体积分数的glutamax，0.1-2％体积分数的青霉素-链霉素-两性霉素b，0.5-2.5％体积分数的hepes，1-5％体积分数的b27，1-5％体积分数的n2，5-30ng/ml egf，5-50ng/ml bfgf，5-20％体积分数的mem非必需氨基酸溶液，20-100μm 2-巯基乙醇，5-20％体积fbs，50-200μg/ml promicin，500-2000u/ml lif。
4、本发明优选的，还包括样本清洗液，所述样本清洗液各组分浓度如下：在1×dpbs中加入0.1-0.5mg/ml透明质酸酶，0.1-5u/ml弹性蛋白酶，0.05-0.5mg/ml脱氧核糖核苷酸酶ⅰ，10-50μm z-vad(oh)-fmk，0.1-3％体积青霉素-链霉素-两性霉素b。
5、本发明优选的，还包括样本消化液，所述样本消化液各组分浓度如下：在advaceddmem/f12中加入使胶原蛋白酶ⅳ终浓度为0.5-2mg/ml，脱氧核糖核苷酸酶i终浓度为0.05-0.5mg/ml，z-vad(oh)-fmk终浓度为10-50μm。
6、2、利用所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，包括如下方法：
7、(1)取神经母细胞瘤肿瘤组织样本，浸没入样本清洗液中清洗；
8、(2)样本清洗后剪碎，然后用样本消化液消化，终止消化后用收集沉淀，沉淀用样本培养基重悬，然后将细胞悬液与matrigel充分混合均匀，将混合物均匀的滴入孔板，静置使基质胶凝固；
9、(3)取出孔板，加入神经母细胞瘤类器官培养基，放入培养箱持续培养7～20天。
10、本发明优选的，步骤(1)中，所述样本清洗液加入量按10倍样本体积加入。
11、本发明优选的，步骤(1)中，所述清洗是将神经母细胞瘤肿瘤组织样本浸没入样本清洗液中，200rpm，25℃恒温摇床震荡孵育60min，期间每20min更换一次样本清洗液。
12、本发明优选的，步骤(2)中，所述剪碎为将组织剪碎至1mm3左右的小块。
13、本发明优选的，步骤(2)中，所述消化为将剪碎的组织加入5倍体积的样本消化液中，于200rpm、37℃恒温摇床震荡孵育5-10min，使用10倍样本消化液体积的advaced dmem/f12终止消化。
14、本发明优选的，步骤(2)中，所述收集沉淀为在4℃，500×g，10min下离心，弃去上清，收集样本沉淀。
15、本发明优选的，步骤(2)中，所述静置使基质胶凝固是在37℃培养箱静置30min使基质胶凝固。
16、本发明的有益效果在于：本发明提供了神经母细胞瘤类器官构建配方，配方中样本清洗液与样本消化液中含有z-vad(oh)-fmk，z-vad(oh)-fmk是z-vad-fmk的羧基化合物形式，亲水的羧基基团可在水溶环境下，自由进入细胞，发挥抑制caspase凋亡途径，从而提升神经母细胞瘤类器官的存活率。
17、样本清洗液中含有弹性蛋白酶，可在清洗液孵育清洗肿瘤样本时，水解除去纤维化组织中网状纤维即弹性蛋白，释放肿瘤细胞。
18、清洗液中含有透明质酸酶，可在清洗液孵育清洗肿瘤样本时，水解去除样本中的透明质酸，释放肿瘤细胞。
19、通过各组分的作用攻克了技术壁垒，赋能精准医疗，提升神经母细胞瘤患儿的生存时间与生存质量。本发明提供的神经母细胞瘤构建方法能够高效转化手术切除的肿瘤样本为神经母细胞瘤类器官，利用matrigel模拟细胞外基质为样本提供3d支撑，持续培养，能较好的维持肿瘤干细胞的干性、保持类器官的肿瘤异质性。
1.一种神经母细胞瘤类器官构建配方，其特征在于：所述配方包括样本培养基，所述样本培养基各组分浓度如下：在advaced dmem/f12中加入1-5％体积分数的glutamax，0.1-2％体积分数的青霉素-链霉素-两性霉素b，0.5-2.5％体积分数的hepes，1-5％体积分数的b27，1-5％体积分数的n2，5-30ng/ml egf，5-50ng/ml bfgf，5-20％体积分数的mem非必需氨基酸溶液，浓度为20-100μm的2-巯基乙醇，5-20％体积的fbs，50-200μg/ml的promicin，500-2000u/ml的lif。
2.根据权利要求1所述一种神经母细胞瘤类器官构建配方，其特征在于，还包括样本清洗液，所述样本清洗液各组分浓度如下：在1×dpbs中加入0.1-0.5mg/ml透明质酸酶，0.1-5u/ml弹性蛋白酶，0.05-0.5mg/ml脱氧核糖核苷酸酶ⅰ，10-50μm z-vad(oh)-fmk，0.1-3％体积青霉素-链霉素-两性霉素b。
3.根据权利要求1所述一种神经母细胞瘤类器官构建配方，其特征在于：还包括样本消化液，所述样本消化液各组分浓度如下：在advaced dmem/f12中加入使胶原蛋白酶ⅳ终浓度为0.5-2mg/ml，脱氧核糖核苷酸酶i终浓度为0.05-0.5mg/ml，z-vad(oh)-fmk终浓度为10-50μm。
4.利用权利要求1～3任一项所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于，包括如下方法：
5.根据权利要求4所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述样本清洗液加入量按10倍样本体积加入。
6.根据权利要求4所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述清洗是将神经母细胞瘤肿瘤组织样本浸没入样本清洗液中，200rpm，25℃恒温摇床震荡孵育60min，期间每20min更换一次样本清洗液。
7.根据权利要求4所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述剪碎为将组织剪碎至1mm3左右的小块。
8.根据权利要求4所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述消化为将剪碎的组织加入5倍体积的样本消化液中，于200rpm、37℃恒温摇床震荡孵育5-10min，使用10倍样本消化液体积的advaced dmem/f12终止消化。
9.根据权利要求4所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述收集沉淀为在4℃，500×g，10min下离心，弃去上清，收集样本沉淀。
10.根据权利要求4所述神经母细胞瘤类器官构建配方构建神经母细胞瘤类器官的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述静置使基质胶凝固是在37℃培养箱静置30min使基质胶凝固。
