一种定量分析多种荧光物质成分的高精度通用方法

1.本发明涉及定量分析技术领域，具体地，涉及一种定量分析多种荧光物质成分的高精度通用方法。


背景技术：

2.荧光定量分析方法是常用的物质分析手段，由于一些物质含荧光发色团，所以在一定波长的激发光激发下会发射荧光，发射荧光的强度正比于激发光的强度以及该类物质的含量(eq.1)：
[0003][0004]
在eq.1中，是指光电探测器所能探测到的范围(被称为中心区域)内荧光组分发射的荧光强度，是荧光物质的荧光量子产率；是激发光强度；是荧光物质的摩尔消光系数；是有效光程，它是指光电探测器所能探测范围内的激发光光程；是荧光物质的浓度。在一定的浓度范围内，这一理论分析依据在许多场合都被证明能够有效地反应分析物的浓度，它被广泛地应用于分析荧光物质的含量，当被分析荧光物质成分单一时，灵敏度高，分析精度也很高。
[0005]
但是，在许多应用领域中，例如生物液体、食品样本、水质检测和石油化工产品等，在这些检测背景下，目标分析物含有多种荧光物质组分。在对于其进行荧光定量分析时，某一待测组分的荧光光谱不可避免地会被另外的一些组分所干扰。当受到特定波长激发光激发时，获得的发射光谱实际上是光与多种荧光组分相作用的综合结果，既包括了各个组分受该波长激发光激发后的荧光发射混叠，也包括了其中一种组分发射的荧光被另一组分吸收。在此情形下，应用eq.1定量其中某组分将出现明显的偏差。也就是说，假设仍然用待测荧光组分特征波长处的荧光强度来定量该组分的含量，依据eq.1，它们的关系是线性的，但是，波长为处的光强有可能混叠有其他的荧光组分发射的荧光，抑或有部分波长为的荧光被其他荧光组分或非荧光组分吸收了。在这样的条件下，eq.1所描述的在特征荧光波长处的简单线性关系就不再成立了。
[0006]
我们把上述的荧光组分之间的荧光混叠和荧光被吸收导致的淬灭(简称为荧光吸收淬灭，可包括荧光组分或非荧光组分对荧光的吸收)统称为荧光光谱串扰。为了解析荧光光谱串扰的机制，假设未发生明显的激发光空间衰减效应，即每一荧光组分单独分析时均是满足eq.1。那么，多组分荧光光谱的荧光混叠可以认为是各个单一荧光组分的荧光光谱的简单线性组合，这样可以通过联立多个eq.1线性组合的方程组或者使用多元线性分析的方法求解，这也是被广泛采用的方法。
[0007]
但在以往的研究工作和实践中，荧光吸收淬灭引起的荧光光谱串扰，往往被有意或者无意地忽略了。仅仅在一些关于三维荧光光谱内滤光校正的研究中被报道，研究者们普遍采用eq.2来校正荧光吸收淬灭的影响。
[0008]
[0009]
式中，是光电探测器探测到的观测荧光强度值，是在中心区域内的理想荧光强度值，是指激发光通过样品池的吸光度，是发射的荧光通过样品池的吸光度。应用eq.2校正三维荧光光谱的内滤光效应，具有良好的效果，但需要满足中心区域位于样品池横截面中心的条件，且需要采用分光光度计单独测定样品的吸收光谱。控制稀释法(controlled dilution approach，cda)是另一种校正荧光吸收淬灭影响的手段，cda适用于三维荧光光谱，但需要额外的实验操作增加样品的测量次数，cda的另外一个缺点是，样本稀释会降低荧光信号的信噪比，有时也会改变溶液中分子的性质从而导致巨大的数据误差。


技术实现要素：

[0010]
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种定量分析多种荧光物质成分的高精度通用方法。
[0011]
根据本发明的一个方面，提供一种定量分析多种荧光物质成分的高精度通用方法，包括：
[0012]
对多种荧光物质成分的原始光谱数据进行预处理，得到光谱数据集；
[0013]
分割所述光谱数据集；
[0014]
根据分割后的光谱数据集，建立串扰荧光光谱分析的定量分析模型，基于所述定量分析模型进行荧光物质成分的定量分析。
[0015]
进一步地，所述对多种荧光物质成分的原始光谱数据进行预处理，包括：
[0016]
获取多种荧光物质的原始荧光光谱数据；
[0017]
根据所述原始荧光光谱数据计算β函数的函数值，并选择n个特征波长。
[0018]
进一步地，所述β函数的表达式为：
[0019][0020]
其中，代表样本中组分的浓度向量，ε(λ
ab
)代表各组分的摩尔消光系数，代表荧光发射量子产率，λ
ab
为吸收波长，λ
em
为荧光发射波长；吸收转化系数γ(λ
ab
)＝μ
·
ψ(λ
ab
)，ψ(λ
ab
)是荧光物质对于波长为λ
ab
的激发光的吸收转化率，μ表示吸收的光有多少被利用来激发产生荧光，μ是在朗伯比尔定律线性浓度范围内吸收激发光iab的泰勒展开中线性项的修正系数，即选取一个合适的μ使得i
ab
＝i0(1-e-2.303εbc
)＝2.303i0εbμc的误差最小。
[0021]
进一步地，所述原始荧光光谱数据的每组样本的荧光光谱数据均为经过五次测量之后的平均值，所述预处理还包括扣除暗电流和s-g平滑处理。
[0022]
进一步地，所述分割所述光谱数据集，包括：将所述光谱数据集分割为训练集、验证集和测试集。
[0023]
进一步地，随机选取所述光谱数据集中30％的光谱数据组成所述训练集，随机选取所述光谱数据集中20％的光谱数据组成所述验证集，随机选取所述光谱数据集中50％的光谱数据组成所述测试集。
[0024]
进一步地，所述建立串扰荧光光谱分析的定量分析模型，包括：
[0025]
在激发光波长的激发光条件下，建立激发光波长和水样中待测荧光成分的荧光特征波长处接收到的光强与待测荧光成分的浓度关系的表达式：
[0026][0027]
基于所述表达式，假设样本中含有n种组分a，b，c
…
，则可从荧光光谱中选取n个波长位置的光谱强度，依据β函数建立定量模型，可以将ci，(i＝a，b，c
…
)写作ci，(i＝1，2，3
…
)，则在第r个波长λr处：
[0028][0029]
在最小均方误差准则下由梯度下降法拟合βr函数以获得仪器常数p
ri
和q
ri
的值，确定定量模型。
[0030]
进一步地，所述训练集至少包含2n个样本，所述样本表示所述训练集中的光谱数据。
[0031]
进一步地，所述基于所述定量分析模型进行荧光物质成分的定量分析，包括：
[0032]
当模型达到最优时，由测得的荧光光谱if(λ)计算β函数的函数值再由所选取的n个波长位置的βr列写方程组，所述方程组为：
[0033][0034]
求解所述方程组计算ci，根据ci计算平均值
[0035]
进一步地，求解所述方程组计算ci，根据ci计算平均值包括：
[0036]
写出所述方程组的jacobian矩阵：
[0037][0038]
随机选定一个浓度向量的初始值通过计算机迭代计算通过计算机迭代计算并且迭代结果将收敛到方程组的解：
[0039][0040][0041]
与现有技术相比，本发明具有如下至少之一的有益效果：
[0042]
本发明采用串扰荧光光谱分析方法对多种荧光物质成分进行定量分析，通过分析荧光光谱串扰的形成和相互转化机制，建立在单个波长激发光激发下多组分荧光物质荧光光谱串扰的解析模型，提出串扰荧光光谱定量分析方法，以此作为定量测量依据，能够统一地解决荧光吸收淬灭和荧光混叠这两方面的影响问题。与现有技术中的三维荧光光谱校正方法相比，本发明的串扰荧光光谱分析方法是一种更为完整的分析方法，具有更高的定量分析精度，而且方法建立过程不依赖于三维光谱，具有通用性。
附图说明
[0043]
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、
目的和优点将会变得更明显：
[0044]
图1是本发明实施例中串扰荧光光谱定量分析方法(cfsa)的流程图；
[0045]
图2是本发明实施例中用于计算机模拟仿真的荧光染料的激发光谱和发射光谱；
[0046]
图3是本发明实施例中用于计算机模拟仿真方式来模拟产生多荧光组分串扰荧光光谱的流程图；
[0047]
图4是本发明一优选实施例的不同浓度下的色氨酸、荧光素钠和罗丹明b的纯溶液的吸收光谱和发射光谱；
[0048]
图5是本发明一优选实施例的测得的所有样本的荧光光谱。波长由短到长的荧光峰依次代表色氨酸、荧光素钠和罗丹明b；
[0049]
图6是本发明一优选实施例的多元线性回归法、偏最小二乘法和cfsa分析法分别对荧光素钠、若丹明b和色氨酸含量的定量分析结果。
具体实施方式
[0050]
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0051]
本发明实施例提供一种定量分析多种荧光物质成分的高精度通用方法，参照图1，该方法包括：
[0052]
s1、对多种荧光物质成分的原始光谱数据进行预处理，得到光谱数据集；
[0053]
在原始光谱数据预处理的步骤中，计算β函数的函数值并根据分析物的荧光分布选定特征波长，具体包括：
[0054]
获取多种荧光物质的原始荧光光谱数据；
[0055]
根据原始荧光光谱数据计算β函数的函数值，并选择n个特征波长。
[0056]
光谱数据集中包含所有测得的荧光光谱，根据其中的每一个荧光光谱就可以计算出一个β函数，再根据特征波长选择β函数中用于建模的数据。计算β函数可以使得最后的定量公式简洁从而简化形式，选定特征波长可以避免在求解模型系数时求解数量极大的系数。其中，β函数为激发光波长和水样中待测荧光成分的荧光特征波长处的接收光强与待测荧光成分的浓度关系的表达式，β函数的表达式为：
[0057][0058]
式1中，代表样本中组分的浓度向量，εi(λ)代表各组分的摩尔消光系数，代表荧光发射量子产率，λ为波长；吸收转化系数γi(λ)＝μ
·
ψ(λ
ab
)，ψ(λ
ab
)是荧光物质对于波长为λ
ab
的激发光的吸收转化率，μ表示吸收的光有多少被利用来激发产生荧光，μ是在朗伯比尔定律线性浓度范围内吸收激发光i
ab
的泰勒展开中线性项的修正系数，即选取一个合适的μ使得i
ab
＝i0(1-e-2.303εbc
)＝2.303i0εbμc的误差最小。
[0059]
n个特征波长的确定方法为：一般地，选择每一种荧光组分的峰值波长，n个组分即选择n个波长。
[0060]
在获取多种荧光物质的原始荧光光谱数据的步骤中，原始荧光光谱数据的每组样
本的荧光光谱数据均为经过五次测量之后的平均值，当然，本领域技术人员还可以对此进行任意适当的调节；此外，对原始光谱数据进行预处理还包括扣除暗电流和s-g平滑处理，扣除暗电流可以降低数据处理时的基线误差，s_g平滑处理则能够降低测量时的噪声。
[0061]
s2、分割光谱数据集；
[0062]
为了避免训练集样本的取样分布不合理，在数据集的分割部分，还设置了一个验证集，以保证训练集样本所确定的定量模型对测试集具有良好的泛化能力。在计算机模拟与实际实验过程中，数据集的分割是随机分割的。分割光谱数据集，具体可以包括：将光谱数据集分割为训练集、验证集和测试集。具体地，随机选取光谱数据集中30％的光谱数据组成训练集，随机选取光谱数据集中20％的光谱数据组成验证集，随机选取光谱数据集中50％的光谱数据组成测试集。
[0063]
s3、根据分割后的光谱数据集，建立串扰荧光光谱分析的定量分析模型，基于该定量分析模型进行荧光物质成分的定量分析。
[0064]
在一些具体的实施例中，建立串扰荧光光谱分析的定量分析模型，包括：
[0065]
在激发光波长的激发光条件下，建立激发光波长和水样中待测荧光成分的荧光特征波长处接收到的光强与待测荧光成分的浓度关系的表达式，即为如(式1)的β函数：
[0066][0067]
基于该表达式，假设样本中含有n种组分a，b，c
…
，则可从荧光光谱中选取n个波长位置的光谱强度，依据β函数建立定量模型，可以将ci，(i＝a，b，c
…
)写作ci，(i＝1，2，3
…
)，在波长确定后，将第一项中的系数写成p，第二项中的系数写成q，则在第r个波长λr处：
[0068][0069]
一个样本的β函数可以列出n个如式2的表达式。定量模型中的仪器常数p
ri
和q
ri
都可以构成一个n
×
n的矩阵，需要确定的常数有2n2个，因此训练集至少需要包含2n个样本，该样本表示训练集中的光谱数据。可以在最小均方误差准则下由梯度下降法拟合βr函数以获得仪器常数p
ri
和q
ri
的值，确定定量模型。
[0070]
依据上述表达式确定定量模型中的仪器常数p
ri
和q
ri
，经过验证集样本验证为具有良好的泛化能力后，便可依据下面的表达式通过迭代求解方程组计算各荧光组分的含量。进一步地，进行荧光物质成分的定量分析，包括：
[0071]
确定参数p
ri
和q
ri
后，当模型达到最优时，即随着迭代的进行，需要拟合的参数p和q不再变化，由测得的荧光光谱if(λ)计算β函数的函数值再由所选取的n个波长位置的βr列写方程组，该方程组为：
[0072][0073]
求解该方程组计算ci，根据ci计算平均值
[0074]
为求解未知样本中n组分的浓度向量为求解方程组计算ci，根据ci计算平均值包括：写出方程组的jacobian矩阵：
[0075]
[0076]
随机选定一个浓度向量的初始值通过计算机迭代计算通过计算机迭代计算并且迭代结果将收敛到方程组的解：
[0077][0078][0079]
本发明实施例中，计算机模拟仿真方式来模拟产生多荧光组分串扰荧光光谱以验证单波长激发光下多组分荧光光谱串扰的理论解析，按照以下步骤执行：
[0080]
选取三种荧光组分用于模拟仿真，我们把它们记作component a、component b和component c，它们单位浓度的激发光谱和发射光谱仿真数据可以来源于常见的荧光染料，例如图2分别是alexa fluor 350、alexa fluor 430和alexa fluor 532。它们的激发光谱和发射光谱如图所示。可以看出，300nm的激发光均可使三种荧光组分发射荧光，三种组分的荧光发射有严重的重叠且有吸收带和荧光发射带的重叠，这会导致明显的荧光吸收淬灭。这样的性质可以验证串扰荧光光谱定量分析方法(cfsa)的有效性。
[0081]
模拟仿真的流程如图3所示。在生成模拟荧光光谱时，每个样本中的三个组分的浓度是通过随机数生成器生成的。结合各组分的吸收光谱，便可以模拟出含有吸收淬灭因素的串扰荧光光谱，生成公式是式(1)。
[0082]
本发明实施例通过理论分析荧光光谱串扰的形成和相互转化机制，建立在单个波长激发光激发下多组分荧光物质荧光光谱串扰的解析模型，提出串扰荧光光谱定量分析方法(coupling fluorescence spectrumanalysis，cfsa)，以此作为定量测量依据，能够统一地解决荧光吸收淬灭和荧光混叠这两方面的影响问题。对于所建立的解析模型和所提出的方法，通过仿真模拟计算和实验验证了荧光混叠和荧光吸收淬灭引起了荧光光谱串扰，并且验证了采用cfsa对多组分荧光物质的定量分析精度都优于采用常规的线性方法，例如多元线性回归(mlr)和偏最小二乘法(pls)，本实施例中的方法具有更高的定量分析精度。
[0083]
以下以实验中使用到三种常见的荧光物质：色氨酸、荧光素钠和罗丹明b为例，对本发明实施例中的定量分析多种荧光物质成分的高精度通用方法作进一步地详细说明。
[0084]
s1、对多种荧光物质成分的原始光谱数据进行预处理，得到光谱数据集；
[0085]
实验中使用到三种常见的荧光物质，依据它们的荧光发射波长由短到长依次是：色氨酸、荧光素钠和罗丹明b。不同浓度下的纯溶液的吸收光谱和发射光谱分别如图4所示。
[0086]
同样地，短波长的荧光发射往往会被长波长荧光发射组分的吸光带所覆盖，从而导致吸收淬灭的发生。虽然色氨酸与其它两种荧光组分的荧光混叠不明显，但是荧光素钠和罗丹明b之间有着明显的荧光混叠现象。
[0087]
使用中心波长为275nm的紫外led光源作为实验的激发光源，可以激发三类荧光组分的荧光信号。
[0088]
浓度配置需要注意的是，样本在实验过程中不能有显著的激发光空间衰减效应。
[0089]
实验的装置可以按照正交接收模式。荧光光谱由光谱仪测得。每组样本的荧光光谱均是经过五次测量之后的平均值。光谱预处理还包括扣除暗电流和s-g平滑处理。
[0090]
s2、分割光谱数据集；
[0091]
在配置三荧光组分样本时，各组分的参考浓也是随机的，一共配置30个样本。
[0092]
在后续的数据分析的过程中将被随机地分割为三个数据集。
[0093]
随后，便可以进入图1所示的定量分析流程。
[0094]
s3、根据分割后的光谱数据集，建立串扰荧光光谱分析的定量分析模型，进行荧光物质成分的定量分析。
[0095]
s31，在激发光波长的激发光条件下，建立激发光波长和水样中待测荧光成分的荧光特征波长处的接收光强与待测荧光成分的浓度关系的表达式。
[0096]
s32，基于s1的表达式，假设样本中含有n种组分a，b，c
…
，则可从荧光光谱中选取n个波长位置的光谱强度，依据β函数建立定量模型。可以将ci，(i＝a，b，c
…
)写作ci，(i＝1，2，3
…
)，则在第r个波长λr处为式(2)所示。一个样本的β函数可以列出n个式(2)。定量模型中的仪器常数p
ri
和q
ri
都可以构成一个n
×
n的矩阵，需要确定的常数有2n2个，因此训练集至少需要包含2n个样本。可以在最小均方误差准则下由梯度下降法拟合βr函数以获得仪器常数p
ri
和q
ri
的值，确定定量模型。
[0097]
s33，待确定仪器常数p
ri
和q
ri
后，在利用该定量模型对测试集中未知的多荧光组分样本进行定量分析时，可以由测得的荧光光谱if(λ)计算β函数的函数值再由所选取的n个波长位置的βr列写方程组：
[0098][0099]
为求解未知样本中n组分的浓度向量为可以先写出该方程组的jacobian矩阵：
[0100][0101]
随机选定一个浓度向量的初始值通过计算机迭代计算通过计算机迭代计算并且迭代结果将收敛到方程组的解：
[0102][0103][0104]
图5是测得的所有样本的荧光光谱，波长由短到长的荧光峰依次代表色氨酸、荧光素钠和罗丹明b。三类荧光组分在光谱中的荧光峰在不同样本中表现出的峰值波长不尽相同，实测的荧光光谱也有明显的吸收淬灭效应。
[0105]
图6是多元线性回归、偏最小二乘法和cfsa分析法分别对荧光素钠、若丹明b和色氨酸含量的定量分析结果。结果显示，cfsa分析法对实际发生的串扰荧光光谱具有良好的定量分析能力，上述对荧光光谱串扰的解析与客观实验结果相吻合。
[0106]
从图6的定量分析结果，可以得到表1和表2的决定系数r2和均方误差结果，从表中可以看出，对于荧光素钠、罗明丹b和色氨酸这三种物质，相较于多元线性回归方法和偏最小二乘法，串扰荧光光谱定量分析方法均具有更高的决定系数r2，以及更小的均方误差，证
明本发明实施例中的串扰荧光光谱定量分析方法具有更高的定量分析精度。
[0107]
表1决定系数r2[0108][0109]
表2均方误差
[0110][0111][0112]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。上述各优选特征在互不冲突的情况下，可以任意组合使用。