本技术涉及一种脂肪间充质干细胞冷冻保存液及其应用，属于细胞冷冻保存。
背景技术：
1、干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）是干细胞家族的成员之一，存在于多种组织如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等，具有多向分化潜力。而其中的脂肪间充质干细胞具有独特的细胞因子分泌功能以及免疫调节和抗炎作用，目前被应用于治疗多种免疫相关的疾病，由于脂肪间充质干细胞能够分泌外泌体，在利用间充质细胞的分泌外泌体制备多种产品用于生物医药的研究也是目前的热点。
2、脂肪间充质干细胞具有分化能力和免疫调节特性，在再生医学领域具有巨大潜力，而低温保存即在超低温下储存细胞，对于维持所需的脂肪间充质干细胞的供应至关重要。扩增后的脂肪间充质干细胞需要被冻存起来，使其在低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命，以备用于科研及临床随时复苏使用或方便运输保存。
3、目前在间充质干细胞的冻存中需要加入冻存保护剂，冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂一般为小分子物质，如甘油、二甲基亚砜(dmso)、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、甲酰胺等，主要作用是防止细胞内的冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水；非渗透性冷冻保护剂主要是一些大分子物质，如海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮等。
4、间充质干细胞的生物活性直接影响其细胞因子分泌功能以及免疫调节和抗炎作用，也会影响其外泌体的分泌效率，因此如果保证间充质干细胞具有较高生物活性的同时，还能满足长时间的保存和运输是非常重要的技术问题。目前常见的间充质干细胞的冻存手段多采用二甲基亚砜、牛血清、培养液等按照一定比例混合后进行细胞的冻存，但是牛血清为动物来源物质，不可应用于临床产品中，dmso对细胞也存在一定的毒性，常温下能使胞内蛋白变性，用血清冻存可能导致干细胞的分化。
5、在冷冻过程中，细胞中的水会形成冰晶，冰晶会刺穿细胞膜并破坏内部结构，导致细胞死亡。冷冻过程中水分的去除会导致细胞内溶质浓度发生变化，从而产生渗透压，导致细胞收缩并破坏细胞成分，从而导致细胞活力降低。二甲基亚砜、甘油、乙二醇或丙二醇等冷冻保护剂能够减少冰晶形成并保护细胞膜，然而它们在高浓度下会产生细胞毒性，因此调整各组分配合以及用量从而平衡冷冻保护效果和减少细胞毒性是至关重要的。
6、普通生理盐水或葡萄糖溶液作为间充质干细胞保存液因营养缺乏，溶液等张力或等渗力等原因，导致细胞在长期保存或运输中出现活力下降、大量溶胀死亡以及细胞结团率升高等现象。含有胎牛血清或细胞培养基的保存液因细胞接触胎牛血清会内吞胎牛血清，进而引起细胞某些蛋白表达特性的变化，当将间充质干细胞回输病人体内后还可能引起过敏反应。此外，冷冻和解冻可能会调节基因表达从而影响mscs自我更新和分化为特殊细胞类型的能力，例如容易导致细胞干性丧失或减弱，或者导致间充质干细胞分泌外泌体的能力下降等。
7、因此目前亟需一种成分稳定、营养物质多元化、渗透压接近血液、缓冲能力强、保存时间久且便于运输的脂肪间充质干细胞保存液，能够在冷冻和解冻后保持脂肪间充质干细胞的活性，具有高效的外泌体分泌能力。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，提供了一种脂肪间充质干细胞冷冻保存液及其应用，本技术提供的冷冻保存液，能够保持脂肪间充质干细胞的细胞活性，并且解冻后具有较好的再生能力，能够保持较高的外泌体分泌能力，细胞因子的表达量也较高，具有重要的产业应用价值。
2、根据本技术的一个方面，提供了一种脂肪间充质干细胞冷冻保存液，由以下成分组成：人血清白蛋白溶液6~10%v/v、海藻糖2~4%w/v、泊洛沙姆188 0.1~0.6%w/v、白藜芦醇1~2%w/v、谷胱甘肽1~2%w/v、聚乙烯醇4~6%w/v和dmso 3~4%v/v，最后将复方电解质注射液和复方氨基酸注射液以1:1补充至100%。
3、可选的，所述人血清白蛋白溶液的体积浓度为20±5%。
4、可选的，所述人血清白蛋白为毕赤酵母发酵的重组人白蛋白。
5、可选的，所述毕赤酵母为gs115、km71、x-33或smd1168h或它们的突变体。
6、可选的，所述聚乙烯醇的分子量为12kda~15kda。实验人员在前期研究中发现，添加使用分子量12kda~15kda的聚乙烯醇能够明显提高冻存细胞复苏后的细胞存活率，猜测此分子量的聚乙烯醇能够与人血清白蛋白配合，提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，从而减少冻存过程中的冰晶造成的细胞损伤，此外增加分子量12kda~15kda的聚乙烯醇后，复苏后的细胞也具有更好的增殖能力。
7、可选的，所述复方氨基酸注射液包含l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-丙氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-门冬氨酸、l-酪氨酸、l-谷氨酸、l-苯丙氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-赖氨酸盐酸盐、l-缬氨酸、l-苏氨酸、l-组氨酸盐酸盐、l-色氨酸、l-蛋氨酸、l-胱氨酸、甘氨酸、山梨醇和亚硫酸氢钠。
8、可选的，所述复方氨基酸注射液每1000ml，含有l-脯氨酸1.00g、l-丝氨酸1.00g、l-丙氨酸2.00g、l-异亮氨酸3.52g、l-亮氨酸4.90g、l-门冬氨酸2.50g、l-酪氨酸0.25g、l-谷氨酸0.75g、l-苯丙氨酸5.33g、l-精氨酸盐酸盐5.00g、l-赖氨酸盐酸盐4.30g、l-缬氨酸3.60g、l-苏氨酸2.50g、l-组氨酸盐酸盐2.50g、l-色氨酸0.90g、l-蛋氨酸2.25g、l-胱氨酸0.10g、甘氨酸7.60g、山梨醇50.00g和亚硫酸氢钠0.50g。
9、可选的，所述复方电解质溶液包含氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。
10、可选的，所述复方电解质溶液每1000ml，含有氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g和氯化镁0.30g。
11、可选的，由以下成分组成：人血清白蛋白溶液8%v/v、海藻糖3%w/v、泊洛沙姆1880.4%w/v、白藜芦醇1%w/v、谷胱甘肽1%w/v、聚乙烯醇5%w/v和dmso 3%v/v，最后将复方电解质注射液和复方氨基酸注射液以1:1补充至100%。
12、根据本技术的另一个方面，提供了任一上述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液在脂肪间充质干细胞冷冻保存中的应用。
13、本技术的有益效果包括但不限于：
14、1．根据本技术的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，能够使得脂肪间充质干细胞保持98%左右的细胞存活率，相比常规冷冻保存液，能够更好地保护细胞内部结构，减少冷冻解冻过程中细胞内溶质浓度的变化，细胞的存活率较高。
15、2．根据本技术的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，冷冻细胞复苏后的脂肪间充质干细胞在进行增殖时，潜伏期更短，且对数生长期的生长效果更好，仍旧保持有较好的细胞干性。
16、3．根据本技术的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，解冻复苏后的脂肪间充质干细胞能够保持较高的外泌体分泌能力，本技术的冷冻保存液通过对各组分的配合和用量的调配，不仅使得冷冻和解冻对脂肪间充质干细胞的影响最小，且冷冻保存液本身对脂肪间充质干细胞的细胞毒性较小。
17、4．根据本技术的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，解冻复苏后的脂肪间充质干细胞的tgf-b、hgf、pge2、il-6细胞因子的分泌量相比常规冷冻保存液更高，可见其仍旧保持较高的细胞因子分泌能力，细胞干性好。
18、5．根据本技术的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，能够保持脂肪间充质干细胞的细胞活性，并且解冻后具有较好的再生能力，能够保持较高的外泌体分泌能力，细胞因子的表达量也较高，具有重要的产业应用价值。
1. 一种脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，由以下成分组成：人血清白蛋白溶液6~10%v/v、海藻糖2~4%w/v、泊洛沙姆188 0.1~0.6%w/v、白藜芦醇1~2%w/v、谷胱甘肽1~2%w/v、聚乙烯醇4~6%w/v和dmso 3~4%v/v，最后将复方电解质注射液和复方氨基酸注射液以1:1补充至100%。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，所述人血清白蛋白溶液的体积浓度为20±5%。
3.根据权利要求2所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，所述人血清白蛋白为毕赤酵母发酵的重组人白蛋白。
4.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量为12kda~15kda。
5.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，所述复方氨基酸注射液包含l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-丙氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-门冬氨酸、l-酪氨酸、l-谷氨酸、l-苯丙氨酸、l-精氨酸盐酸盐、l-赖氨酸盐酸盐、l-缬氨酸、l-苏氨酸、l-组氨酸盐酸盐、l-色氨酸、l-蛋氨酸、l-胱氨酸、甘氨酸、山梨醇和亚硫酸氢钠。
6.根据权利要求5所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，所述复方氨基酸注射液每1000ml，含有l-脯氨酸1.00g、l-丝氨酸1.00g、l-丙氨酸2.00g、l-异亮氨酸3.52g、l-亮氨酸4.90g、l-门冬氨酸2.50g、l-酪氨酸0.25g、l-谷氨酸0.75g、l-苯丙氨酸5.33g、l-精氨酸盐酸盐5.00g、l-赖氨酸盐酸盐4.30g、l-缬氨酸3.60g、l-苏氨酸2.50g、l-组氨酸盐酸盐2.50g、l-色氨酸0.90g、l-蛋氨酸2.25g、l-胱氨酸0.10g、甘氨酸7.60g、山梨醇50.00g和亚硫酸氢钠0.50g。
7.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，所述复方电解质溶液包含氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁。
8.根据权利要求7所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，所述复方电解质溶液每1000ml，含有氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g和氯化镁0.30g。
9. 根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液，其特征在于，由以下成分组成：人血清白蛋白溶液8%v/v、海藻糖3%w/v、泊洛沙姆188 0.4%w/v、白藜芦醇1%w/v、谷胱甘肽1%w/v、聚乙烯醇5%w/v和dmso 3%v/v，最后将复方电解质注射液和复方氨基酸注射液以1:1补充至100%。
10.权利要求1~9任一项所述的脂肪间充质干细胞冷冻保存液在脂肪间充质干细胞冷冻保存中的应用。
