本发明属于纳米孔检测领域，具体涉及一种检测样本中目标核酸的存在的方法。
背景技术：
1、作为传感器的跨膜孔(例如纳米孔)已经在核酸检测领域展现出巨大的潜力。当分子通过纳米孔内部的通道时，特定的阻塞电流和易位事件产生。根据分子的阻塞电流和易位频率，可以实现对目标分子的定性和/或定量分析。一些具有合适通道孔径的蛋白质纳米孔已被用于纳米生物技术的应用，如α-溶血素(α-hl)、mspa、csgg、气单胞菌溶素(aerolysin)、phi29连接器等。这些蛋白质纳米孔主要来自细菌孔蛋白或病毒门，并且有大约为单链dna(ssdna)或双链dna(dsdna)大小的孔径(1.0nm-3.6nm)。因此，它们适用于检测核酸，并已被用于dna/rna测序、核酸生物标记物检测和生物分子相互作用研究。
2、然而，目前的基于纳米孔的检测思路是使单个多核苷酸(dna/rna)通过孔并直接鉴定核苷酸。因此，往往需要多核苷酸结合蛋白(例如解旋酶、聚合酶)来作为多核苷酸通过纳米孔的分子制动器。例如，cn106459159b公开了一种使用纳米孔表征目标多核苷酸的方法。该方法需要辅助的“分子制动器”的参与，即需要使多核苷酸与构建的纳米孔和多核苷酸结合蛋白接触，以使得多核苷酸移动穿过纳米孔且这种移动受多核苷酸结合蛋白的控制。cn110168104a公开了一种使用纳米孔表征分析物的方法。该方法不仅需要多核苷酸结合蛋白的参与，还需要对纳米孔进行标签修饰以及可以附接于双链多核苷酸的衔接子来提高互补链的过孔概率。上述方法的测序体系复杂，成本昂贵，且无法满足临床等应用场景中对核酸检测技术快速、便捷的需要。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种检测样本中目标核酸的存在的方法，具体技术方案如下。
2、一种检测样本中目标核酸的存在的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3、s1将样本置于核酸扩增体系并进行核酸扩增，确定所述核酸扩增体系中底物核苷酸的数量，获得所述样本的核酸扩增产物；
4、s2将所述样本的核酸扩增产物加入单通道电生理检测系统，所述单通道电生理检测系统包括：跨膜孔、绝缘膜、第一介质、第二介质，其中所述跨膜孔被嵌入所述绝缘膜中，所述绝缘膜将所述第一介质与所述第二介质分隔开，所述跨膜孔提供连通所述第一介质与所述第二介质的通道，所述样本的核酸扩增产物被加入到所述第一介质；
5、s3向所述第一介质和所述第二介质之间施加驱动力，所述样本的核酸扩增产物中剩余核苷酸与所述跨膜孔相互作用并产生电信号；
6、s4对所述电信号进行量化，获得所述剩余核苷酸的数量；
7、s5将所述剩余核苷酸的数量与所述底物核苷酸的数量进行对比，确定所述样本中所述目标核酸是否存在。
8、进一步地，所述跨膜孔为mscs变体埃米孔。
9、进一步地，所述mscs变体包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
10、进一步地，所述mscs变体埃米孔的开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的。
11、进一步地，所述开口的调节方式包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化。
12、进一步地，所述机械力刺激包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
13、进一步地，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
14、(1)所述第一介质和所述第二介质的种类选择；和/或
15、(2)所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差。
16、进一步地，所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差是通过所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差来调节的。
17、进一步地，所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差为大约0-270mm。
18、进一步地，所述第一介质和/或所述第二介质包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。
19、进一步地，所述mscs变体埃米孔源自杆菌。
20、进一步地，所述mscs变体埃米孔包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
21、进一步地，所述mscs变体埃米孔为pamscs变体埃米孔。
22、进一步地，所述pamscs变体埃米孔包括130a、130h、180r、271i、130s和130p
23、中的一种或多种。
24、进一步地，通过聚合酶链反应、连接酶链反应、链置换扩增技术、转录介导的扩增技术、环介导等温扩增技术中的一种或多种进行所述核酸扩增。
25、进一步地，所述核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。
26、进一步地，所述核苷酸包括dgtp、datp、dttp、dctp、dutp、gtp、atp、ttp、ctp、utp中的一种或多种。
27、进一步地，所述核酸扩增体系进一步包括：
28、(1)探针，所述探针包括互补区和重复区，所述互补区包括与所述目标核酸互补配对的序列，所述重复区包括重复同一个碱基的寡核苷酸序列，所述碱基包括a、t、c、g、u；或者
29、(2)所述目标核酸的特异性引物。
30、进一步地，所述目标核酸为冠状病毒核酸。
31、进一步地，所述冠状病毒包括sars-cov-2、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov和mers-cov中的一种或多种。
32、进一步地，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。
33、另一方面，本发明还提供一种病毒快速检测试剂盒，包括：
34、(1)mscs埃米孔；
35、(2)绝缘膜；
36、(3)电导液；
37、(4)所述病毒的核酸的特异性引物或探针。
38、进一步地，所述mscs埃米孔包括mscs的侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
39、进一步地，所述绝缘膜包括磷脂膜和/或高分子膜。
40、进一步地，所述电导液包括氯化钠溶液、氯化锂溶液、氯化铯溶液、氯化钾溶液和溴化钠溶液中的一种或多种。
41、进一步地，所述埃米孔为pamscs变体埃米孔。
42、进一步地，所述埃米孔包括130a、130h、180r、271i、130s和130p中的一种或多种。
43、与现有技术相比，本发明的有益效果：
44、本发明提供了一种利用单通道电生理检测系统检测样本中目标核酸的存在的方法。
45、1)本发明提供的方法可以快速检测样本中目标核酸的存在。传统的核酸检测方法通常需要对目标核酸进行荧光标记或染色，因此，其依赖昂贵的荧光监测设备或染色体系。目前基于纳米孔的核酸检测方法，往往需要辅助性的多核苷酸结合蛋白(例如解旋酶、聚合酶)等复杂的体系。本发明提供的方法利用跨膜孔，仅需检测体外核酸扩增体系(例如底物dntps、聚合酶、反转录酶)中底物dntps的消耗，进而判断核酸扩增体系里是否存在目标核酸，具有快速、成本低、易于高通量检测、特异性和敏感性较佳的优势。本发明涉及的跨膜孔能够检测(或区分)不同核苷酸，且不受核酸扩增体系中的其他物质(例如，扩增出的核酸、酶)的干扰。
46、2)作为优选，本发明的跨膜孔为mscs(小电导机械力敏感性通道)埃米孔，其孔径狭窄、孔径可调(也可以理解为结构灵活)。据估计，mscs埃米孔的孔径范围为～6-16埃米，远小于现有技术中常用的纳米孔(例如，α-溶血素纳米孔的孔径约为1.4-2.4nm，即14–24埃米)。mscs埃米孔可在毫秒内将机械刺激转化为电信号或生化信号，从而引发通道构型的调节。利用mscs埃米孔对绝缘膜所受到的机械力刺激和/或绝缘膜的物理状态变化的敏感性，可以通过影响绝缘膜来实现对mscs埃米孔孔径的调整，无需繁复的化学修饰。例如，可以调整第一介质和第二介质的浓度(即30mm nacl/300mm nacl、100mm nacl/300mmnacl和300mmnacl/300mm nacl)来调整绝缘膜两侧的渗透压差进而调节孔径，实现优化对dntps的选择性并提高对dntps的区分。现有技术中的蛋白质纳米孔通常具有固定的通道结构，对核苷酸(例如，dntp等类似分子)的直接检测通常需要额外的蛋白质工程修饰或者化学修饰引入。而本发明涉及的mscs埃米孔的孔径只需改变外界条件即可实现可逆性原位调整，适用于对核苷酸直接地单分子传感识别(也可以理解为对核苷酸的直接检测)。
47、如本文所使用，术语“源自”不仅是指所讨论的生物菌株产生的蛋白质，还指由分离自此类菌株的dna序列编码且在含有此类dna序列的宿主生物中产生的蛋白质。
1.一种检测样本中目标核酸的存在的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述跨膜孔为mscs变体埃米孔，所述mscs变体可选地包括侧孔体积变体和/或侧孔电荷变体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mscs变体埃米孔的开口的电荷性质和/或孔径大小是可调节的；所述开口的调节方式可选地包括使所述绝缘膜受到机械力刺激和/或使所述绝缘膜的物理状态变化，所述机械力刺激可选地包括所述绝缘膜两侧的介质的渗透压差变化、微针对所述绝缘膜的直接物理刺激和气压负压对所述绝缘膜的刺激中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述开口的孔径可以根据以下方式来调节：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一介质与所述第二介质之间的渗透压差是通过所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差来调节的，所述第一介质与所述第二介质之间的浓度差可选地为大约0-270mm。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mscs变体埃米孔源自杆菌，可选地包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、腾冲嗜热厌氧菌和幽门螺杆菌中的一种或多种。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述mscs变体埃米孔为pamscs变体埃米孔，可选地包括以下变体的一种或多种：130a、130h、180r、271i、130s和130p。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，所述核苷酸可选地包括dgtp、datp、dttp、dctp、dutp、gtp、atp、ttp、ctp、utp中的一种或多种。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增体系进一步包括：
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标核酸为冠状病毒核酸，所述冠状病毒可选地包括sars-cov-2、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov和mers-cov中的一种或多种。
11.一种病毒快速检测试剂盒，包括：
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述埃米孔为pamscs变体埃米孔，可选地包括130a、130h、180r、271i、130s和130p中的一种或多种。
