本发明涉及油脂加工，尤其涉及一种多级孔二氧化硅固定化脂肪酶及其制备方法和在生产结构油脂制品中的应用。
背景技术：
1、以天然食用油脂为原料，化学或酶法处理可以使油脂分子中的脂肪酸置换或重组，使之具有特定功能，这种在化学结构上与天然油脂有明显差别的新型油脂称为结构油脂。甘油二酯油就是这样一类结构油脂，它对维护人们身体健康，预防和缓解由于不良生活方式引起的代谢综合症有着重要的作用。
2、化学催化法可应用于结构油脂生产，其反应位置随机，所得到的改性油脂仅能满足结构脂中对脂肪酸组成的要求，不能满足脂肪酸位置特殊分布的要求，从而影响产品生物生理功能以及应用性能。此外，在化学催化下，会存在催化条件剧烈而导致多不饱和脂肪酸氧化，引起结构油脂产品质量下降等问题。甘油二酯油生产早期多采用化学法生产，但因反应专一性差、产生缩水甘油脂肪酸酯等有毒有害化学物质、反应步骤繁冗、需大量化学试剂等原因已较少采用。
3、生物催化法具有高度的区域选择性及环境友好性。用于油脂改性的生物催化剂一般为脂肪酶，脂肪酶对以甘油三酯为底物的脂肪酸位置有高度专一性。目前，从产品安全性、功能性和环境友好等方面考虑，越来越多的生物催化技术用于实际生产。甘油二酯油生产可采用脂肪酶酶解法，常用酶解方法包括酶促水解法和酶促甘油解法，其中酶促油脂水解属于脂类的油水界面反应，水在油中分散的越细，界面越大，反应速度越快。搅拌速度、油水比例以及乳化剂用量均影响界面大小，但目前的机械搅拌和混合等难于克服反应的传质限制，导致反应速度慢，副反应多，产品质量不稳定。脂肪酶酶促油脂甘油解法中反应体系的水分含量较少，反应条件较易控制，并可以实现甘油二酯异构体之间转化。
4、通常情况下，液体脂肪酶的催化活性中心被包埋在一或多个α螺旋结构的多肽“盖子”下，使其活性中心与底物隔离，导致其没有催化活性。脂肪酶在非水体系反应中，其活性中心被掩盖，不能很好显示催化功能，需要有效激活其活性。在少量水存在下，由于脂肪酶的“界面活化”现象，覆盖活性位点的α螺旋结构（即“盖子”）被打开，催化活性中心暴露，从而显示出催化活性。对于油脂甘油解制备甘油二酯的反应来讲，由于甘油亲水性强且与油脂互不相溶，脂肪酶难以在甘油/水-油脂界面上实现高效化学反应。为了提高结构油脂的生成效率，现有技术常采用固定化酶催化的方法，即将脂肪酶用物理吸附或化学键合的方法固定在多孔载体上，通过载体高比表面积扩大脂肪酶与底物的有效接触面积，提高结构油脂的生成速度。
5、固定化脂肪酶的表面孔尺寸也是影响其催化活性的重要因素。大量研究表明，多孔材料由于其较大的比表面积，是固定化脂肪酶的合适载体。但是，油脂大分子在常规多孔材料固定化脂肪酶上存在扩散和传质障碍，影响其催化油脂改性反应的性能。液态油脂分子粘度较大，尺寸一般在3-4 nm，在常规固定化脂肪酶表面的传质阻力较大，可减低其催化油脂甘油解的活性。以mcm-41和sba-15为代表的介孔材料，因其可调节的孔体积及高比表面积而成为固定化酶的理想载体。然而，这些介孔材料虽然具有高比表面积，由于其介孔尺寸限制，油脂大分子在其表面仍然有传质阻力。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明主要目的是提供一种多级孔二氧化硅固定化脂肪酶及其制备方法，并将其应用于生产结构油脂制品。该固定化脂肪酶可改善油脂大分子在其表面的扩散和传质，适应于催化油脂大分子参与的化学反应。该方法制得的固定化脂肪酶具有比表面积大、孔径分布合理、酶负载量高等特点。
2、为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
3、一种多级孔二氧化硅固定化脂肪酶的制备方法，包括步骤：
4、s1、三维有序多级孔sio2载体的制备：首先在ph为1-2的条件下，将三嵌段聚合物p123（本发明以下简称“p123”）和正硅酸乙酯置于第一反应溶剂中搅拌混合，并使正硅酸乙酯完全水解；再加入聚甲基丙烯酸甲酯pmma（本发明以下简称“pmma”）微球搅拌混合均匀，干燥，得到sio2载体前驱体；然后对所述sio2前驱体进行煅烧处理，粉碎，可得到多级孔sio2载体材料，该多级孔sio2中分布有有序分层排列的介孔和大孔；
5、s2、多级孔载体材料的氨基修饰：采用3-氨丙基三乙氧基硅烷对所述多级孔sio2进行氨基化处理，得到氨基化多级孔材料；
6、s3、脂肪酶的固定化：先将所述氨基化多级孔材料和戊二醛溶液混合均匀，再加入含有脂肪酶的磷酸盐缓冲溶液进行搅拌反应，过滤，洗涤，冷冻干燥，得到多级孔二氧化硅固定化脂肪酶。
7、其中，所述步骤s1主要是以pmma作为大孔模板剂，以p123作为介孔模板剂制备具有大孔介孔的多级孔sio2载体固定化脂肪酶。
8、所述步骤s1可以包括：先将p123溶于第一溶剂中加入浓盐酸溶液调节ph值为1-2；再在搅拌下加入正硅酸乙酯，使正硅酸乙酯完全水解，得到水解溶液；然后向所述水解溶液中加入所述pmma微球并搅拌1-2 h，减压蒸馏除去其中的第一溶剂，剩余物在恒温烘箱中干燥，得到所述多级孔sio2前驱体；将所述sio2前驱体置于马弗炉中进行煅烧，粉碎，可得到所述多级孔sio2载体。
9、为进一步优化反应，在所述步骤s1中，pmma和p123的质量比优选为：0.4:1 - 1 :0.3，所述第一反应溶剂为50%乙醇水溶液或50%甲醇水溶液，所述第一反应溶剂为p123质量的10-15倍。正硅酸乙酯与p123质量比优选为1:2，正硅酸乙酯的水解反应温度优选为30-50℃，反应时间优选为24 h。所述sio2前驱体的煅烧温度优选为500℃-600℃，煅烧时间优选为5-8 h。
10、所述多级孔sio2载体为三维大孔/介孔多级结构材料（3dom/m材料），其中的介孔和大孔有序分层排列，且所述介孔的孔径优选为2-3 nm，所述大孔的孔径优选为300-350nm。优选地，所述3dom/m材料的比表面积为310-500 m2/g；更优选地，所述3dom/m材料的比表面积为330-450 m2/g。
11、所述步骤s2的主要目的是在所述多级孔sio2上连接氨基，以便后续处理过程中，增强脂肪酶和多级孔sio2的结合强度。具体包括步骤：将所述多级孔sio2载体悬浮在第二反应溶剂中，滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述多级孔sio2发生氨基化反应；反应完毕后，过滤，得滤饼；采用所述第二反应溶剂洗涤所述滤饼，真空干燥，制得所述氨基化多级孔载体材料。
12、其中，所述多级孔sio2与3-氨丙基三乙氧基硅烷的重量份优选为1 : 0.3-0.6，两者的反应温度优选为100℃-110℃，反应时间优选为1-3 h。所述第二反应溶剂优选为甲苯、乙苯、二甲苯等。
13、所述步骤s3的主要目的是将脂肪酶固定在所述氨基化多级孔载体材料上，通过其中的氨基与脂肪酶形成化学键，增强脂肪酶与多级孔sio2的连接。具体地，该步骤包括：先将所述氨基化多级孔载体材料和戊二醛溶液置于反应器中，并于室温下搅拌均匀；再加入所述含有脂肪酶的磷酸盐缓冲溶液，持续搅拌反应5-10 h，直至反应结束，获得固定化脂肪酶半成品；然后过滤，获得所述固定化脂肪酶半成品，并依次利用磷酸盐缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，得到所述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶。其中，所述戊二醛溶液的主要作用是作为交联剂分别于氨基和脂肪酶形成化学键，从而使得脂肪酶牢固固定在多级孔sio2上。优选地，所述氨基化多级孔材料、戊二醛溶液、脂肪酶的质量比为1 : (5-10) : (0.5-5)；所述磷酸盐缓冲溶液的ph为7.0。所述脂肪酶为candida rugosa脂肪酶、lipozyme rm im脂肪酶或国产同等类型脂肪酶等。
14、本发明的另一目的是提供一种由上述方法制得的多级孔二氧化硅固定化脂肪酶，包括氨基化多级孔sio2载体材料和固载在所述氨基化多级孔材料上的固定化脂肪酶，其中，所述氨基化多级孔载体材料为三维硅基多级孔材料，是由所述多级孔sio2经氨基化处理制得，所述多级孔sio2包括在其中有序分层排列的介孔和大孔结构。其中，所述介孔的孔径优选为2-3 nm，所述大孔的孔径优选为300-350 nm，所述脂肪酶主要用于催化油脂的水解、甘油解、酯化和酯交换反应。
15、进一步，所述脂肪酶是以化学键合的方式与所述氨基化sio2多级孔材料相连接，主要是通过戊二醛交联剂分别与多级孔sio2载体材料中氨基和脂肪酶中氨基形成化学键。其中，所述脂肪酶的负载量优选为80-150 mg/g，单位酶活性优选为5000-7000 u/g。更优选地，所述脂肪酶的负载量为84-140 mg/g，单位酶活性为5100-6600 u/g。
16、本发明的又一目的在于提供一种上述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶在生产甘油二酯油中的应用。优选地，所述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶的用量为油脂原料质量的13%-15%。
17、由于上述3dom/m载体材料结合了大孔与介孔结构的优点，其中的大孔可提供有效的物质扩散和质量传输，介孔可以提供较大的比表面积和结构稳定性，而且介孔较大的比表面积能够增加活性中心暴露度。所以，上述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶特别适应于油脂大分子和高粘度物料参与的化学反应，其作为催化剂，具有反应物传质阻力小、酶活性中心暴露度高、催化活性好的优势。因此，上述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶可作为生产甘油二酯油的专用催化剂，催化油脂水解、甘油解反应，生产甘油二酯油制品，有效提高了油脂和甘油反应制取甘油二酯油的转化率。
18、因此，本发明提供的上述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶，主要以pmma和p123分别作为大孔和介孔模板剂制备具有大孔介孔的多级孔sio2载体，通过控制pmma和p123的质量比调控多级孔二氧化硅载体中的大孔和介孔的多级孔分布，并通过化学键将脂肪酶固载到该多级孔sio2载体上。所以，上述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶中的孔径分布可调，比表面积适中，其中的大孔能增加油脂大分子的传质能力，介孔可增加催化剂的比表面积；且其中的脂肪酶的负载量大，活性高，并在油脂体系中易分散、不团聚，有效缓解了油脂大分子传质阻力问题。
19、上述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶因脂肪酶被化学键牢固地固定在多级孔载体上，催化稳定性好，在使用后可方便回收利用，经长周期循环使用8次，其催化油脂甘油解的活性没有明显损失，制得的甘油二酯油制品中的甘油二酯含量不低于40%。
20、本发明提供的上述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶的制备工艺简单，反应条件温和，生产成本低。
1.一种多级孔二氧化硅固定化脂肪酶的制备方法，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1包括：先将p123溶于第一反应溶剂中，加入浓盐酸溶液调节ph值为1-2；再在搅拌下加入p123质量份两倍的正硅酸乙酯，使正硅酸乙酯完全水解，得到水解溶液；然后向所述水解溶液中加入所述pmma微球并搅拌1-2 h，减压蒸馏除去其中乙醇，剩余物在恒温烘箱中干燥，得到所述sio2前驱体；将所述sio2前驱体置于马弗炉中进行煅烧，粉碎，得到所述多级孔sio2。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤s1中，所述第一反应溶剂为50%乙醇水溶液或50%甲醇水溶液，所述第一反应溶剂为p123质量的10-15倍；
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤s1中，正硅酸乙酯的水解反应温度为30℃ - 50℃，反应时间为24 h；所述sio2前驱体的煅烧温度为500℃-600℃，煅烧时间为5-8 h。
5.根据权利要求1或2或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s2包括：将所述多级孔sio2悬浮在第二反应溶剂中，滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述多级孔sio2发生氨基化反应；反应完毕后，过滤，得滤饼；采用所述第二反应溶剂洗涤所述滤饼，真空干燥，制得所述氨基化多级孔载体材料；
6.根据权利要求1或2或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s3包括：先将所述氨基化多级孔材料和戊二醛溶液置于反应器中，并于室温下搅拌均匀；再加入所述含有脂肪酶的磷酸盐缓冲溶液持续搅拌反应5-10 h，直至反应结束，获得固定化脂肪酶半成品；然后过滤，将所述固定化脂肪酶半成品依次利用磷酸盐缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，得到所述多级孔二氧化硅固定化脂肪酶；
7.一种由权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的多级孔二氧化硅固定化脂肪酶，其特征在于，包括氨基化多级孔载体材料和通过化学键固定在所述氨基化多孔载体材料上的脂肪酶，其中，所述氨基化多孔载体材料由所述多级孔sio2经氨基化处理制得，所述多级孔sio2包括在其中有序分层排列的介孔和大孔结构；
8.根据权利要求7所述的多级孔二氧化硅固定化脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的负载量为80-150 mg/g，单位酶活性为5000-7000 u/g；
9.根据权利要求8所述的多级孔二氧化硅固定化脂肪酶，其特征在于，所述多级孔sio2的比表面积为310-500 m2/g；
10.一种权利要求7或8或9所述的多级孔二氧化硅固定化脂肪酶在生产结构油脂制品中的应用，其中，所述结构油脂制品为甘油二酯油制品；
