本发明属生物，具体涉及一种用于检测甲型流感病毒h3n2亚型的引物组、检测方法和应用。
背景技术：
1、据美国疾病控制和预防中心的说法，h3n2病毒是甲型流感病毒的一个亚型，与更严重的疾病和更高的死亡率有关，特别是在幼儿、老年人和有潜在健康状况的人中。世界卫生组织(who)报告称，h3n2是全球大多数流感相关住院和死亡的原因。甲型流感病毒是引起严重呼吸道疾病的主要病原体之一，它存在多种亚型，其中h3n2亚型在人类中广泛流行。对h3n2亚型进行准确和早期的检测对于流感疫情监测、疫苗研制和临床诊断具有重要意义。传统的检测方法主要采用病毒分离和免疫学技术进行，但这些方法耗时较长且对设备和专业技术要求较高。因此，开发一种快速、灵敏和特异性的引物组、检测方法和应用对于h3n2亚型的检测具有重要意义。近年来，分子生物学的发展为流感病毒的检测提供了新的技术手段。基于pcr技术的引物组和检测方法已被广泛应用于流感病毒的检测，具有高度特异性和灵敏性，并可以在短时间内得到检测结果。
2、h3n2病毒具有高度传染性，当感染者咳嗽或打喷嚏时，会通过呼吸道飞沫传播。h3n2感染的症状与季节性流感相似，包括发烧、喉咙痛、咳嗽、疲劳和身体疼痛。虽然大多数人在一周内从h3n2感染中恢复过来，但在某些情况下，它可能导致严重的并发症，如肺炎、支气管炎，甚至死亡。h3n2流感病毒在过去5个相当严重的流感季节中的3个中占主导地位。流感疫苗的h3n2成分对预防共循环毒株感染的保护效力较差(28％～42％)。自引入人类以来，h3n2流感病毒在基因和抗原上迅速进化，试图逃避宿主的免疫压力。人类h3n2 iav的快速突变率导致每2至5年出现一次抗原性新型病毒。taqman pcr(polymerase chain reaction)是一种高度敏感和特异的核酸检测技术，通常用于检测病毒、细菌、真菌等微生物的存在。
技术实现思路
1、本发明旨在解决上述问题之一，提出一种甲型流感病毒的检测方法，采用taqmanrt-qpcr方法进行甲型流感病毒原始株与突变株的检测与区分缩短了检测鉴定的时间；引入taqman探针提升检测灵敏度和特异性；rt-qpcr方法可应用于多数检测单位配备的荧光定量pcr仪即可完成对病毒变异株的准确鉴定，克服对昂贵测序仪的依赖降低了测试的成本。
2、本发明第一方面的目的，在于提供一种试剂。
3、本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
4、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒的应用。
5、本发明第四方面的目的，在于提供一种检测甲型流感病毒的rt-qpcr检测方法。
6、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
7、本发明的第一个方面，提供一种试剂，包括引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示，
8、h3-f：5’-cgggtacggacaatgaccaa-3’，
9、h3-r：5’-tctgctggggacatccctta-3’，
10、h3-p：5’-ccaaaagaagccaacaaaccgtaatccc-3’；和/或
11、n2-f：5’-cctttgacaatggaaatgacg-3’，
12、n2-r：5’-tgacttgcctatttatctgcga-3’，
13、n2-p：5’-tggatgggaagaacgatcagcaa-3’。
14、在本发明一些实施方式中，所述探针的序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团。
15、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团为fam、hex、vic、tamra、rox、texas-red和cy5中的至少一种。
16、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团为tamra、mgb、bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种。
17、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团连接在探针的5’端。
18、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团连接在探针的3’端。
19、在本发明一些优选实施方式中，所述h3-p的5’端连接荧光基团fam，3’端连接淬灭基团bhq1。
20、在本发明一些优选实施方式中，所述n2-p的5’端连接荧光基团hex，3’端连接淬灭基团bhq1。
21、本发明的第二个方面，提供一种包含本发明第一方面的试剂的试剂盒。
22、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括pcr反应液和阳性标准品。
23、在本发明一些实施方式中，所述pcr反应液包括质粒模板、引物、探针、2×taq prohs universal u+prob e master mix(包含dna聚合酶、dntps、缓冲液、镁离子)。
24、本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用：
25、(1)鉴别甲型流感病毒；
26、(2)制备检测或辅助检测甲型流感病毒的产品；
27、(3)检测待测样品是否为甲型流感病毒；
28、(4)制备检测或辅助检测待测样品是否为甲型流感病毒的产品；
29、(5)检测待测样品是否感染甲型流感病毒；
30、(6)制备检测或辅助检测待测样品是否感染甲型流感病毒的产品；
31、上述应用用于非疾病的诊断和治疗。
32、在本发明一些实施方式中，所述甲型流感病毒为甲型流感病毒h3n2。
33、本发明的第四个方面，提供一种检测甲型流感病毒的rt-qpcr检测方法，包括使用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
34、在本发明一些实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：
35、1)从待测样品中提取核酸；
36、2)以步骤1)的核酸为模板，用所述试剂或所述试剂盒进行rt-qpcr扩增反应，收集荧光信号；
37、3)根据荧光信号判定待测样品中是否含有或是甲型流感病毒。
38、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为500～150nm，上/下游引物终浓度为100～300nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
39、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为20～100nm，上/下游引物终浓度为200～250nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
40、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应程序为：40～55℃，4～6min；94～96℃，20～40s；94～96℃，2～10s，55～65℃，15～30s，35～45个循环。
41、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应程序为：50～55℃，5～6min；94～96℃，30～40s；95～96℃，5～10s，60～65℃，20～30s，35～40个循环。
42、在本发明一些实施方式中，所述检测方法的结果判定方法为：根据荧光信号判定待测样品中是否含有或是甲型流感病毒。
43、在本发明一些实施方式中，所述甲型流感病毒为甲型流感病毒h3n2。
44、本发明的有益效果是：
45、本发明提供的试剂可用于对甲型流感病毒进行检测，可快速检测鉴定甲型流感病毒，且具备极高的检测敏感性与特异性，检测结果准确可靠。
46、本发明提供的rt-qpcr检测方法具有以下优点：
47、提高检测速度，减少对昂贵仪器的依赖。该专利技术在病毒鉴定中的应用速度从6到8小时缩短到1小时，而且这种技术方法不依赖昂贵的测序仪，只需要普通的荧光光学定量pcr仪就可完成，减少对测序仪等昂贵仪器的依赖，节省样本转移时间，最大程度减少不可控因素。
48、提高检测灵敏度。基于taqman探针法rt-qpcr检测病毒核酸变异，检测灵敏度可高达1copies/μl，rt-qpcr扩增信号可实现病毒核酸变异检测，避免微弱的扩增信号对基于基因测序对核酸变异检测的影响。
49、降低检测成本，提高检测通量。该技术的整个实验过程仅包括病毒核酸的提取和qrt pcr两步，实验步骤少，所需材料和人工成本大大降低，可通过96或384孔反应板，方便实现样品的高通量。
50、污染率低，易于操作。通过当前的测序技术检测病毒突变需要病毒rna提取、rt-pcr扩增、pcr产物纯化、机器测序等步骤，批量操作容易引入操作污染，此方法只需病毒rna提取和rt-qpcr两步操作，步骤减少相应操作污染也减少，很容易实现一次检测大量样本。
51、单独使用或与其他引物探针结合使用时，每个鉴别位点的引物探针的性能是不同的：单独使用时不受其他引物影响。与其他引物结合时，易受其影响，需相互鉴别对引物探针用量、反应条件、阳性结果判定阈值等位点进行了优化。
1.一种试剂，包括引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示，
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述探针的序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述荧光基团为fam、hex、vic、tamra、rox、texas-red和cy5中的至少一种；和/或，所述淬灭基团为tamra、mgb、bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3中任一项所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应液和阳性标准品。
6.权利要求1～3中任一项所述的试剂或权利要求4或5所述的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用：
7.一种检测甲型流感病毒的rt-qpcr检测方法，包括使用权利要求1～3中任一项所述的试剂和/或权利要求4或5所述的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为50～150nm，上/下游引物终浓度为100～300nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应程序为：40～55℃，4～6min；94～96℃，20～40s；94～96℃，2～10s，55～65℃，15～30s，35～45个循环。
