本申请涉及环境生物，尤其涉及一种定量土壤中真菌和细菌的引物探针组合、试剂盒、方法和应用。
背景技术：
1、准确测量环境土壤中的真菌和细菌的浓度及比例具有重要意义。目前，常用pcr的扩增来测量土壤中的真菌和细菌的比例，但是，高盐碱土壤中的高盐含量及多种抑制因子会妨碍pcr扩增反应的进行，从而影响微生物群落中真菌和细菌浓度的准确检测与定量分析。此外，由于真菌dna和细菌dna的内在差异和引物效率的不同，相关技术在同时检测真菌与细菌时遇到了重大挑战。
技术实现思路
1、有鉴于此，本申请的目的在于提出一种定量土壤中真菌和细菌的引物探针组合、试剂盒、方法和应用。
2、基于上述目的，本申请第一方面提供了一种利用微滴数字pcr定量土壤中真菌和细菌的引物探针组合，包括its探针和16s探针，所述its探针的核苷酸序列为：fam-ctsgcatcgatgaagaacgcagc-bhq，其中，fam的结构式如下式1所示，bhq的结构式如下式2所示：
3、
4、所述16s探针的核苷酸序列为vic-tgycagcmgccgcggtaatwc-bhq，其中，vic为4,7-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素；
5、其中，上述核苷酸序列中，s代表c或g。
6、可选地，还包括its引物对和16s引物对，其中，所述its引物对的正向引物的核苷酸序列为：5′-aactttyrrcaayggatcwct-3′；
7、所述its引物对的反向引物的核苷酸序列为：5′-tcctccgcttgatatgc-3′；
8、所述16s引物对的正向引物的核苷酸序列为：5′-cctacgggaggcagcag-3′；
9、所述16s引物对的反向引物的核苷酸序列为：5′-ggactachvgggtwtctaat-3′；
10、上述核苷酸序列中，k代表g或t；r代表a或g；y代表c或t；s代表c或g；b代表g、t或c。
11、本申请第二方面提供了一种定量土壤中真菌和细菌的试剂盒，包括上述第一方面任一项所述的引物探针组合。
12、可选地，还包括探针法ddpcr反应预混液。
13、本申请第三方面提供了一种利用微滴数字pcr定量土壤中真菌和细菌的方法，包括：
14、提取土壤样本的基因组dna；
15、以所述基因组dna为模板经权利要求1～2任一项所述的引物探针组合放入微滴发生仪中生成微滴并扩增，得到扩增产物；
16、基于微滴读取器对所述扩增产物进行荧光检测并分别确定扩增产物中的细菌拷贝数和真菌拷贝数；
17、基于所述细菌拷贝数和真菌拷贝数，计算得到所述土壤样本中的细菌dna浓度和真菌dna浓度。
18、可选地，所述扩增的体系为：探针法ddpcr反应预混液12.5μl、浓度为10μm的its正向引物和its反向引物各2.25μl、浓度为10μm的its探针0.625μl、浓度为10μm的16s探针0.625μl、浓度为10μm的16s正向引物1.125μl、浓度为10mm的16s反向引物1.6875μl、基因组dna 1.25μl、无菌水2.6875μl。
19、可选地，所述扩增的程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火及延伸1min，44个循环。
20、可选地，按照如下公式计算土壤样本中的细菌dna浓度，
21、
22、可选地，按照如下公式计算土壤样本中的真菌dna浓度，
23、
24、本申请第四方面提供了一种上述第一方面任一项所述的引物探针组合、第二方面任一项所述的试剂盒或第三方面任一项所述的方法在定量土壤中真菌和细菌的含量或浓度中的应用。
25、从上面所述可以看出，本申请提供的定量土壤中真菌和细菌的引物探针组合、试剂盒、方法和应用，引物探针组合包括its探针和16s探针，its探针和16s探针具有不同的荧光基团和不同的核苷酸序列，如此its探针和16s探针可以根据不同的荧光基团进行荧光检测，以发出位于不同荧光通道的荧光信号，如此在利用微滴数字pcr定量土壤中真菌和细菌时，16s引物对用于扩增细菌dna，16s探针用于识别和检测细菌dna的扩增产物并发出荧光信号，而its引物对用于扩增真菌dna，its探针用于识别和检测真菌dna的扩增产物并发出荧光信号，由于16s探针和its探针发出的荧光信号位于不同的荧光通道，因此就可以采用不同的荧光通道来分别对细菌dna和真菌dna进行检测，并基于不同荧光通道内的不同荧光强度来分别定量细菌dna和真菌dna的浓度，且两个荧光通道之间没有互相干扰，因此可以实现在同一个样本中准确且单独地测定细菌和真菌的含量。
1.一种利用微滴数字pcr定量土壤中真菌和细菌的引物探针组合，其特征在于，包括its探针和16s探针，所述its探针的核苷酸序列为：fam-ctsgcatcgatgaagaacgcagc-bhq，其中，fam的结构式如下式1所示，bhq的结构式如下式2所示：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括its引物对和16s引物对，其中，所述its引物对的正向引物的核苷酸序列为：5′-aactttyrrcaayggatcwct-3′；
3.一种定量土壤中真菌和细菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括探针法ddpcr反应预混液。
5.一种利用微滴数字pcr定量土壤中真菌和细菌的方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述扩增的体系为：探针法ddpcr反应预混液12.5μl、浓度为10μm的its正向引物和its反向引物各2.25μl、浓度为10μm的its探针0.625μl、浓度为10μm的16s探针0.625μl、浓度为10μm的16s正向引物1.125μl、浓度为10mm的16s反向引物1.6875μl、基因组dna 1.25μl、无菌水2.6875μl。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述扩增的程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火及延伸1min，44个循环。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，按照如下公式计算土壤样本中的细菌dna浓度，
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，按照如下公式计算土壤样本中的真菌dna浓度，
10.一种权利要求1～2任一项所述的引物探针组合、权利要求3～4任一项所述的试剂盒或权利要求5～9任一项所述的方法在定量土壤中真菌和细菌的含量或浓度中的应用。
