本发明属于疾病筛查，涉及一种马遗传病筛查的基因芯片。
背景技术：
1、马遗传病是由遗传物质异常引起的，会影响马的运动能力、生殖能力、免疫系统等方面。
2、其中马多趾(polydactyly)是马四肢上有额外的趾，多趾会导致马匹跛行，易骨折，需要及时治疗，国内已有多例多趾马的报道。
3、糖原分支酶缺乏症、多糖贮积性肌病、周期性高血钾性麻痹、小脑营养性衰竭、马皮肤弹力过度综合征、交界性大疱性表皮松解症、弗里斯兰脑积水也是马常见的遗传病，严重影响马的神经、皮肤、肌肉和运动性能，且目前无较好的治疗方法。
4、目前，我国仅对首次引进的种畜要求提供主要遗传缺陷的相关材料，对后续引进种畜健康检测存在较大的漏洞。而作为马匹身份证的芯片，可能存在数据读取失败或未开放相关数据权限的问题，无法获知马匹是否存在遗传性疾病，容易引进带有遗传风险的马匹，严重影响马产业的可持续发展。因此，对马进行遗传病检测具有重要意义，可以在马匹繁殖前及时识别出潜在的遗传病，防止疾病在后代中扩散，并有助于辅助马匹进口检验检疫工作，牢牢把住马匹进口检查关卡，保障我国育种安全。
5、目前，国外illumina已研发出马50k芯片(illumina equine snp50beadchip)、马70k芯片(illumina equine snp70 beadchip)进行马分子育种，但其是国外知识产权，且其高密度芯片价格高昂，无法大规模用于育种中。国内研发出检测马疱疹病毒-1(ehv-1)、马动脉炎病毒(eav)、马流感病毒(eiv)、马传染性贫血病毒(eiav)和东部马脑脊髓炎病毒(eeev)物种马病毒的诊断基因芯片，但是基于遗传病检测的芯片仍是空白。因此在保证分子育种的应用效果同时，降低成本，及时淘汰基因缺陷的种马，规避疾病风险，保障我国马育种安全是当务之急。
6、靶向捕获测序基因型分型(gbts)液相芯片技术以重测序和靶向捕获为基础，比起固相芯片，其缺失数据少，数据重复性高，影响因素少，因而结果更准确。其通过捕获测序，大大减少了冗余数据的产生，减少了数据处理难度。此外，gbts技术对平台要求低，流程较为规范，也适用于普通实验室建立检测平台。
7、因此，基于gbts技术开发马遗传病检测芯片，可以降低成本，及时淘汰基因缺陷的种马，规避疾病风险，保障我国育种安全，并实现大规模筛选马匹遗传病相关基因，填补我国马遗传缺陷检测空白，缩短育种周期，提高育种效率，加快品种选育进程，并为评估育种效果提供依据。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种马遗传病筛查的基因芯片，以能够同时准确、快速地筛查马的多种遗传病，其中包括多趾。
2、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，所述的基因芯片包括针对不同的靶核酸的探针，所述的不同的靶核酸包括多趾相关的基因。
3、马通常为单趾，马的多趾(polydactyly)表型是四肢上有额外的趾。多趾被证明与lmbr1基因上的突变有关，本技术人更通过研究发现其与马chr4：107353368从a到g的突变有关，即与lmbr1基因第三外显子上第55个氨基酸位置处从异亮氨酸(i)变为缬氨酸(v)的突变有关。具体研究发现过程如下：
4、建立了一个由七个个体马组成的半同胞家系，用于检测多趾候选基因。这个家系是通过将一只具有多趾的伊犁马雄性个体与三只具有正常足趾表型的雌马进行交配而构建的，f1代包含三匹马。雄性亲本(1号马)是在伊犁马群体中发现的四肢都有额外趾的八趾个体；雌性亲本(2、3、4号马)是具有不同特征的三匹马，它们的四肢均表现为正常。在f1代中，两只雄马(5、6号马)显示出多趾，一只雌马(7号)的足为正常。
5、多趾候选基因筛查方法的总体框架如下：首先，使用30倍深度进行全基因组重测序来构建与多趾相关的单核苷酸多态性(snp)数据集。与多趾相关的snps经过三步的筛选，第一步为根据遗传模式筛选snps，第二步为扩充阴性群体过滤假阳性snps，第三步根据基因注释筛选与多趾相关的基因(以上内容参见图1)。
6、对七个个体进行了全基因组高通量测序。通过调取变异位点，每个个体筛选到了约七百万个单核苷酸多态性(snp)和70万个插入/缺失(indels)。多趾可以遗传给后代，但其遗传方式尚未得到充分证实。通过表型观察推测出四种遗传方式，包括常染色体显性、常染色体隐性、x连锁隐性和y连锁遗传。共有25686个snps符合预测的四种遗传方式。在这些snps中，13183个snps符合显性遗传，12127个符合隐性遗传，376个符合y连锁遗传。其中，12127个snps基因型符合隐性遗传，并位于1586个基因上，其中包括80个非同义突变位于66个基因的外显子区域。13183个snps符合显性遗传，位于1756个基因上。其中1136个snps是外显子的非同义突变，分布在263个基因上。
7、表1个体基因型预测结果
8、
9、为了消除由基因背景差异引起的假阳性位点，使用了包含100个个体、12个品种的较大群体进行位点验证。共鉴定出位于65个基因上的77个snp，并对这些基因进行了功能注释。本发明发现，在这65个基因中，编码肢体发育膜蛋白1(lmbr1)的ensecag00000024396基因与肢体发育有关。因此，本发明选择lmbr1作为马科动物多趾症候选基因，对其上面的突变位点进行后续的功能验证。
10、lmbr1基因(ensecag00000024396)位于马的第四染色体(chr4)，全长156830个碱基对，包含18个外显子，编码由436个氨基酸组成的肢体发育膜蛋白。它是lmbr家族膜蛋白的成员之一，已被证明是脂类卡路里跨膜受体。本发明发现lmbr1第三外显子存在一个新的变异位点，该突变位于蛋白质序列的第55个氨基酸位置处，将氨基酸序列从异亮氨酸(i)变为缬氨酸(v)，此位置位于lmbr1功能域内(图2a)。蛋白结构分析表明，该位点的突变并未影响蛋白质的三维结构。
11、为了验证变异位点与多趾的关系，进行了群体验证和细胞学功能验证。
12、群体验证：一代测序结果显示，在突变体中，这个基因的测序峰图显示变异位点为杂峰，包括a和g碱基的两个峰，所有非变异位点为单峰；在正常个体中，变异位点显示碱基为a的单峰(图3a)。为了验证该研究所用群体中多趾畸形个体的基因型是杂合的，进行了单克隆分析。通过从突变体个体中挑选该基因片段的单个菌落，成功获得了两种不同的单倍型菌落(图3b)，证实了突变体个体为杂合。根据本发明对lmbr1变异位点分析的结果，发现该位点的基因型符合常染色体显性遗传。当该位点的等位基因为显性杂合基因型lmbr1 l/l时，马表现出多趾畸形；当等位基因为纯合隐性基因型lmbr1 l/l时，马趾数正常(图3c)。为了验证此变异位点在多趾马中是特异的，扩大群体对该位点进行了序列分析，使用了包括伊犁马在内的13个品种、总共66个正常型个体，构建了具有遗传背景差异的多品种测序群体，利用这些群体可以避免由于品种特异性而产生的假阳性结果。测序结果表明，与图3d中的多趾马相比，这66个正常型个体在lmbr1基因上都是同样的基因型，即lmbr1 l/l。以上结果表明，本发明鉴定的变异位点在多趾个体中是特异的，并且不受品种间遗传背景的影响，在该位点的变异与多趾现象高度相关。
13、细胞验证：本实验所用的细胞为马骨髓间充质干细胞，基于发现的lmbr1变异位点的位置，构建了定点突变载体。根据发现的snp位点所在位置，提取序列及载体yo-rp003酶切位点特征确定酶切位点和酶，在靠近靶位点的pam序列设计grna，引导cas9核酸内切酶进行切割，使dna双链断裂，然后以外源携带目标点突变的oligo作为模板进行同源重组修复(homologous recombination，hdr)，将目标点突变重组到基因组靶位点，完成lmbr1基因点突变载体构建。对照载体为一段无意义的grna组成。
14、grna序列：atgaagatgccatagtcaacagg
15、scremble grna：gtgtagttcgaccattcgtg
16、oligo序列：
17、tagaaacagaacaattaaactttaaaatacatacgaaattctgttgactacggcatct tcatcttcttgttcatctgcaaaaacatttaaggtattaatt
18、yko-rp003-lmbr1载体图谱和yko-rp003-对照载体图谱见图5。
19、使用lipo3000转染试剂将定向突变载体和对照载体转染到马骨髓间充质细胞中，利用crispr/cas9和同源重组编辑lmbr1基因(图4a)。与对照组相比，转染后突变组细胞形态无明显变化，并且在24小时内在干细胞中均匀分布绿色荧光(图4b)。使用流式细胞术过滤阳性细胞，收集带有绿色荧光的细胞继续培养。第一代测序的序列验证结果显示，目标位点的碱基已成功从a替换为g(图4a)。突变位点(a->g)后，lmbr1表达水平显著下调(图4c)。
20、有研究表明，马的趾发育受凋亡和增殖调节。因此，本发明对变异位点对增殖和凋亡的作用进行了实验。为研究lmbr1的突变位点是否影响凋亡，使用gapdh作为参考基因检测lmbr1的表达。利用实时荧光定量pcr技术以gapdh为内参基因，对凋亡标志基因cas3、cas7、cas8基因，下游通路基因shh、ptch1、smo、glia及lmbr1自身检测其mrna表达水平，结果表明，与对照组相比，lmbr1位点突变后促进凋亡的基因casp3的表达显著降低(p<0.05)，casp7的表达极显著降低(p<0.05)；而凋亡抑制基因bcl-2的表达则显著增加(p<0.01)(图4d)。为了分析位点突变后细胞的迁移能力是否发生改变，进行了细胞划痕实验分析。将分选出来成功转染的细胞铺在24孔板中，待细胞长满后，使用白色枪头与灭菌直尺划出两条成十字交叉的空白划痕，并用适量pbs冲洗两次，洗去残留的细胞，在0h、24h、48h和72h观察并拍照，以十字的左侧点为观测点。根据细胞划痕实验的结果，在72小时后，lmbr1位点突变组的细胞填补创伤区域的速度比对照组的细胞更快(图4e)。为探索位点突变对细胞增殖的影响，利用cck-8检测了转染后0小时、12小时、24小时和36小时的细胞增殖活力，发现细胞增殖活力在转染后的12小时上升，在24小时时对照组与突变组的细胞增殖活力有显著差异(图4f)。以上结果表明，lmbr1位点突变后细胞的增殖和迁移能力得到了提高，而细胞凋亡则被抑制。
21、shh通路参与了多种物种的趾发育，并且其蛋白浓度梯度与趾发育有关。在先前的研究中，更高的shh蛋白浓度将结合ptch1以去抑制smo运输，抑制全长gli3转变为gli3r，并增加全长gli3a蛋白浓度，从而激活诸如ptch1和hhip之类的基因。该通路中的lmbr1通过调节shh的表达水平影响shh通路的信号传导。在本发明中，突变外显子是否会影响shh的表达水平是影响通路的关键，因此本发明分析了lmbr1位点突变后通路其他关键基因表达水平的变化。结果显示，lmbr1第三外显子上的位点突变显著下调了shh基因表达水平，并且ptch1和glia的表达水平也下调了(图4g)。
22、以上结果表明，lmbr1第三个外显子上的位点突变很可能通过影响casp3、casp7、bcl-2、shh、ptch1和glia基因表达水平来调控趾发育，并进而与马多趾的发生有关联，且该位点在以往研究中并未发现，本发明首次发现该位点与多趾之间的关系。
23、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中所述的多趾相关的基因为lmbr1基因或其片段，并包含从a到g的突变位点equcab3.0 chr4：107353368。
24、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中所述的靶核酸还包括与马皮肤弹力过度综合征、弗里斯兰脑积水、小脑营养性衰竭、多糖贮积性肌病、周期性高血钾性麻痹、糖原分支酶缺乏症、交界性大疱性表皮松解症相关的基因。
25、马皮肤弹力过度综合征(hereditary equine regional dermal asthenia,herda)是由ppib基因发生错义突变(g.129307092g>a)引起的，患马常表现为脱皮、皮肤松弛、开放创、黏液瘤和血肿，多发于夸特马，该等位基因频率为2.1％，夸特马中的患病率为3.5％，截牛马中发病率稍高，为28％。
26、弗里斯兰脑积水(megacolon(overo lethal white foal syndrome))是由于b3galnt2基因发生错义突变(g.76887901c>t)引起的，表现为母马流产、死产，新生马驹有严重的神经衰弱和颅骨膨胀，解剖死亡马匹可见脑积水，在温血马、夸特马、迷你马等品种中有发现。
27、小脑营养性衰竭(cerebellar abiotrophy,ca)是由于mutyh基因的单核苷酸多态性导致(g.13122415g>a)，以小脑浦肯野细胞变性、凋亡为特征，体征表现为共济失调、震颤痉挛和辨认距离能力下降等，主要发生于阿拉伯马。
28、多糖贮积性肌病(polysaccharide storage myopathy,pssm)是由于gys1基因发生错义突变(g.19203501g>a)，导致机体糖原合成失控以及糖原有氧代谢障碍引起的，其特征是间歇性劳力性横纹肌溶解发作和过多的肌糖原沉积和支链淀粉积累，表现为虚弱、肌肉萎缩、疼痛或僵硬等。
29、周期性高血钾性麻痹(hyperkalemic periodic paralysis,hypp)是由于scn4a基因发生错义突变(g.15474228c>g)，钠离子通道开放时间增长引起的，产生肌强直和瘫痪，其特征是反复发作的肌肉僵硬，表现为全身无力和血清k+浓度升高，主要发生于夸特马及与其有关联血统的品种。
30、糖原分支酶缺乏症(glycogen branching enzyme deficiency,gbed)是由于gbed基因发生无义突变(g.8667651c>a)，导致糖原分支酶i基因的外显子i中出现终止密码子，使糖原分支酶的合成受阻引起的，其特征是在心肌或骨骼肌中高碘酸希夫染色阳性和糖原储存障碍，表现为母马妊娠末期流产，初生马驹通常猝死、进行性肌无力、呼吸衰竭，低血糖等。
31、交界性大疱性表皮松解症(junctional epidermolysis bullosa,jeb)是由于lamc2基因发生无义突变(g.17498175insc)，使肽链合成提前终止，导致蛋白结构发生改变，其以皮肤和黏膜发生水疱和溃疡为特征，也常表现为脱毛、蹄壁分离，多发于美国鞍马、勃拉本松马以及挽马。
32、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中：
33、所述的马皮肤弹力过度综合征相关的基因为ppib基因或其片段，并包含从g到a的突变位点equcab3.0 chr1：129307092；
34、所述的弗里斯兰脑积水相关的基因为b3galnt2基因或其片段，并包含从c到t的突变位点equcab3.0 chr1：76887901；
35、所述的小脑营养性衰竭相关的基因为mutyh基因或其片段，并包含从g到a的突变位点equcab3.0 chr2：13122415；
36、所述的多糖贮积性肌病相关的基因为gys1基因或其片段，并包含从g到a的突变位点equcab3.0 chr10：19203501；
37、所述的周期性高血钾性麻痹相关的基因为scn4a基因或其片段，并包含从c到g的突变位点equcab3.0 chr11：15474228；
38、所述的糖原分支酶缺乏症相关的基因为gbed基因或其片段，并包含从c到a的突变位点equcab3.0 chr26：8667651；
39、所述的交界性大疱性表皮松解症相关的基因为lamc2基因或其片段，并包含位点equcab3.0 chr5：17498175和紧邻其的5’前端插入的碱基c。
40、上述前6个equcab3.0位点为snp，最后一个为定位于马参考基因组equcab3.0上的1个indel。
41、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中分别针对马皮肤弹力过度综合征、弗里斯兰脑积水、小脑营养性衰竭、多趾、多糖贮积性肌病、周期性高血钾性麻痹、糖原分支酶缺乏症相关的基因的探针的序列分别如seq id no:1-7所示，针对交界性大疱性表皮松解症相关的基因的探针的序列如seq id no:8和seq id no:9所示，具体如下：
42、tctgtcttcttcctgctgttgccaggaccctccacggccgatgag aagaagaaggggcctaaagtcactgtcaaggtctggcctcccctctc cagacctgcctggcgagg，用于捕获马皮肤弹力过度综合征的chr1：129307092；
43、gacagcctgtggctgtgtgagaagacttgtgaaacaggaatgtt gtcttccccgcagtattctccacaggaactgacagaactgtggaaac tgaaggagttgtgtggtga，用于捕获弗里斯兰脑积水的chr1：76887901；
44、cataccttgtctggctgctgcttaaagcaggcgaggcccaggga gaggatagaacgggtcctggcagcatgacacacggccttgtaacgtt cctcgatgcaccttggggt，用于捕获小脑营养性衰竭的chr2：13122415；
45、agaattagaaacagaacaattaaactttaaaatacatacgaaa tcctgttgactatggcatcttcatcttcttgttcatctgcaaaaacat ttaaggtattaattttttt，用于捕获多趾的chr4：107353368；
46、ccccacctctctcaagacctgggtatctggcccacatacccata aaaatggccacgcacaaactcctggattcgggccttgctctgagcat ggaggttctggaactcatg，用于捕获多糖贮积性肌病的chr10：19203501；
47、gccaatactacttcaccgttggctggaacatcttcgacttcgtgg ttgtcatcctgtccattgtgggtgagcaggaccagcctgggctgagt cattcaggaaggcctggt，用于捕获周期性高血钾性麻痹的chr11：15474228；
48、ggcggccctggcggacgtgcccgacctgggccgccttctggagg tcgacccgtacctgaagccctacgccccggacttccagcgcaggtac cgcccggccgcgctcgccc，用于捕获糖原分支酶缺乏症的chr26：8667651；
49、ctggctcacttctctgcctcccaggagactgttactcaggggatgagaaccctgacatccctgagtgtgccgactgccccattggtttctacaacgatccacaagacccc和
50、atccctgagtgtgccgactgccccattggtttctacaacgatccacaagacccccgcagctgcaagccgtgcccctgtcgcaatgggttcagctgctccgtgatgcctga，用于捕获交界性大疱性表皮松解症的chr5：17498175。
51、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中所述的探针为生物素标记的探针。
52、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中所述的基因芯片为液相芯片或固相芯片。
53、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中所述的基因芯片为gbts液相芯片。
54、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种马遗传病筛查的基因芯片，其中所述的gbts液相芯片包括针对不同的靶核酸的探针的混合液和杂交捕获试剂。
55、本发明的有益效果在于，利用本发明的马遗传病筛查的基因芯片，能够同时准确、快速地筛查马的多种遗传病，其中包括多趾。
56、本发明能够同时准确、快速地筛查马的多种与神经系统、皮肤、运动性能等相关的遗传病，其中包括多趾，并优选进一步包括马皮肤弹力过度综合征、弗里斯兰脑积水、小脑营养性衰竭、多趾、多糖贮积性肌病、周期性高血钾性麻痹、糖原分支酶缺乏症、交界性大疱性表皮松解症。
57、本发明的有益效果具体体现在：
58、(1)本发明基于常见的马遗传病，根据马遗传病相关位点筛选出可用于基因芯片设计的7个snp位点，1个indel位点，利用设计的基因芯片可以实现8种马遗传病筛查，在辅助马分子育种中具有较高的应用价值。
59、(2)本发明所涉及的马遗传病筛查靶向液相芯片，不仅可以对遗传病进行鉴定，同时可以及时筛选出携带隐性致病基因的马匹，对马分子育种具有开创性意义，弥补了马遗传病筛查液相芯片的空缺，更可以提高马的福利、保护马的遗传资源。
60、(3)本发明所涉及的gbts马遗传病筛查靶向液相芯片，以重测序和靶向捕获为基础，准确性高，具有较好的灵敏性。与固相芯片相比，gbts标记开发技术简便，开发测试成本远低于传统的固相芯片；与重测序相比，gbts通过捕获测序，大大减少了冗余数据的产生，减少了数据处理难度。
1.一种马遗传病筛查的基因芯片，其特征在于：所述的基因芯片包括针对不同的靶核酸的探针，所述的不同的靶核酸包括多趾相关的基因。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的多趾相关的基因为lmbr1基因或其片段，并包含从a到g的突变位点equcab3.0 chr4：107353368。
3.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的靶核酸还包括与马皮肤弹力过度综合征、弗里斯兰脑积水、小脑营养性衰竭、多糖贮积性肌病、周期性高血钾性麻痹、糖原分支酶缺乏症、交界性大疱性表皮松解症相关的基因。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于：
5.根据权利要求3或4所述的基因芯片，其特征在于：分别针对马皮肤弹力过度综合征、弗里斯兰脑积水、小脑营养性衰竭、多趾、多糖贮积性肌病、周期性高血钾性麻痹、糖原分支酶缺乏症相关的基因的探针的序列分别如seq id no:1-7所示，针对交界性大疱性表皮松解症相关的基因的探针的序列如seq id no:8和seq id no:9所示。
6.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的探针为生物素标记的探针。
7.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的基因芯片为液相芯片或固相芯片。
8.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：所述的基因芯片为gbts液相芯片。
9.根据权利要求8所述的基因芯片，其特征在于：所述的gbts液相芯片包括针对不同的靶核酸的探针的混合液和杂交捕获试剂。
