发明领域本发明涉及基于细胞的体外方法用于测量感光视杆细胞外节的吞噬的用途。
背景技术：
0、背景
1、视网膜色素上皮细胞(rpe)是下面的脉络膜(视网膜后面的血管层)和上面的视网膜视觉细胞(例如感光细胞——视杆细胞和视锥细胞)之间的感觉神经视网膜外的色素化细胞层。rpe对于感光细胞和视网膜的功能和健康至关重要。rpe通过回收感光色素，传递、代谢和储存维生素a，吞噬感光视杆细胞外节，在视网膜和脉络膜之间运输铁和小分子，维持布鲁赫膜和吸收杂散光以允许更好的图像分辨率来保持感光细胞功能。参见例如wo2009/051671；engelmann and valtink(2004)“rpe cell cultivation.”graefe’sarchivefor clinical and experimental ophthalmology 242(1):65-67；irinaklimanskaya,retinal pigment epithelium derived from embryonic stem cells,于stem cell anthology 335-346(bruce carlson ed.,2009)。
2、rpe变性能够导致视网膜脱离，视网膜不典型增生或视网膜萎缩，这与导致感光细胞损伤和失明的许多改变视力的疾病有关，如脉络膜血症，糖尿病性视网膜病，黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性，amd)和眼底黄斑营养不良(stargardt’s macular dystrophy，smd)，后两者分别是世界上成人和青少年失明的两个主要原因。虽然两者目前无法治疗，但在黄斑变性的临床前模型中有证据表明移植hesc衍生的rpe可挽救感光细胞并阻止视力丧失(lund rd,wang s,klimanskaya i,et al.human embryonic stem cell-derived cellsrescue visual function in dystrophic rats.cloning and stem cells 2006；8,189-199；lu b,malcuit c,wang s,et al.long-term safety and function of rpe fromhuman embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration.stemcells 2009；21,2125-2135)。
3、还促进上述一些疾病是有丝分裂后神经元细胞的额外损失。这些视网膜疾病包括视杆细胞或视锥细胞营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性(rp)，糖尿病性视网膜病变，黄斑变性，莱伯先天性黑内障和眼底黄斑症(stargardt disease)。在大多数视网膜变性的病例中，细胞丢失主要在包括视杆细胞和视锥细胞感光细胞的外核层(onl)中。
4、感光细胞的潜在替代来源包括干细胞。早期研究评估了小鼠细胞，小鼠干细胞或异质视网膜祖细胞群作为失去感光细胞的替代细胞的可能来源。这些早期研究描述了从出生后第1天的小鼠视网膜移植感光祖细胞(maclaren et al.nature 444(9):203-207,2006)，从小鼠胚胎干细胞体外产生视网膜祖细胞(ikeda et al.proc.natl.acad.sci.102(32):11331-11336,2005)，从出生后第1天的小鼠视网膜产生视网膜祖细胞(klassen etal.invest.ophthal.vis.sci.45(11):4167-4175,2004)，将骨髓间充质干细胞植入视网膜变性的rcs大鼠模型(inoue et al.exp.eye res.8(2):234-241,2007)，从h1人胚胎干细胞系产生视网膜祖细胞，包括神经节细胞，无长突细胞，其中总细胞的0.01％表达s-视蛋白或视紫红质的感光细胞，双极细胞和水平细胞(lamba et al.proc.natl.acad.sci.10(34):12769-12774,2006)，并且从人成纤维细胞诱导诱导性多能干细胞(ips)以产生视网膜祖细胞(lamba et al.plos one 5(1):e8763.doi:10.1371/journal.pone.0008763)。这些方法都没有产生用于植入的均质感光祖细胞或感光细胞群。这些方法都没有产生显示出体内视杆细胞或视锥细胞功能(例如，通过赋予视敏度改善能够检测)的均质感光祖细胞或感光细胞群。感光细胞和感光祖细胞可能从其中分离的供体衍生组织(例如尸体、胎儿组织和活体动物)的供应受到限制。干细胞可以体外无限增殖和扩增，为人治疗提供了非供体来源细胞的潜在来源。将干细胞分化成均质感光祖细胞或感光细胞群可以提供用于植入和治疗视网膜疾病的非供体衍生细胞的大量供应。感光祖细胞可具有吞噬活性。
5、在共同拥有的2010年11月17日提交的美国专利申请序列号13/510,426和pctus2012/65091中公开了某些主题，包括制备rpe细胞的方法，rpe细胞的组合物，以及针对rpe细胞的释放测定(包括吞噬测定)，这样的教导通过引用结合于此。共同拥有的pctus2014/029790中公开了某些主题，包括制造感光祖细胞的方法，以及感光祖细胞的组合物和测试功能的方法(包括吞噬测定)，这样的教导通过引用结合于此。
技术实现思路
0、概述
1、已经使用fitc标记的感光细胞外节(os)(通常是牛或猪)来研究视网膜色素上皮(rpe)在体外的吞噬。然而，用于吞噬评估的大多数定量方法(facs，荧光酶标仪)不区分表面结合的和内化的颗粒，因此不能专门解释涉及表面受体结合和内化吞噬阶段的机制。此外，fitc荧光对ph敏感，并且fitc荧光在ph低于6时显著降低，而溶酶体和与溶酶体融合的吞噬体的ph低于5。因此，fitc标记的os的荧光可能不能真正代表内化os的量。
2、本文提供了用于检测感光细胞外节的内化吞噬的更灵敏和准确的测定，这是rpe细胞和感光祖细胞功能的重要量度，因此是用于治疗视网膜疾病的rpe细胞和感光祖细胞的重要发布标准，视网膜疾病如视锥细胞或视杆细胞营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性，脉络膜血症，糖尿病性视网膜病，黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性和近视性黄斑变性)，莱伯先天性黑内障和眼底黄斑症(fundus flavimaculatus)。参见例如wo 2009/051671。
3、本文所述的rpe细胞在移植后起作用。为此，rpe细胞在接受移植细胞的受试者(或患者)中的感觉神经视网膜和脉络膜之间形成单层。rpe细胞还可以向邻近的感光细胞提供营养，并通过吞噬处理脱落的感光细胞外节。
4、可以基于许多功能和/或表型特征(包括但不限于吞噬活性)来选择适于移植的rpe细胞。例如，可根据其吞噬活性以及其增殖效能评估适于移植的rpe细胞。例如，rpe细胞可具有比来自眼供体的细胞更大的增殖效能(例如，rpe细胞比眼供体的“年轻”)。这使得本文描述的rpe细胞比来自眼供体的细胞具有更长的有用寿命。
5、rpe细胞效能在临床背景中的一个关键参数是rpe细胞药物制剂的外节吞噬活性的定量测量。外节的吞噬导致被吞噬的细胞片段积累在rpe细胞的低ph隔室中。本发明提供了已经与能够以分光光度法检测的可检测标志物结合(即共价或非共价结合)以提供分光光度信号的感光细胞外节，所述可检测标志物选择性地在存在于中性ph或生理ph，即7-7.5的ph时具有第一分光光度信号，并且当存在于细胞内隔室的低ph环境例如溶酶体、吞噬体、内吞体等中时具有第二分光光度信号。第一分光光度信号和第二分光光度信号之间的差异可以是荧光发射的程度(相对于中性ph在低ph下增加的强度)，中性与低ph之间的荧光发射波长的改变，中性和低ph值之间的荧光激发波长的改变等等中的一种或多种。
6、在某些实施方案中，可检测标志物可以是荧光ph传感器，例如荧光染料。可用于本发明的示例性荧光染料可以是具有作为对ph敏感的指示剂部分的氨基(脂肪族或芳香族)的荧光染料部分，所述氨基即在培养基的ph下未质子化的胺，其中将rpe细胞和外节一起孵育(即中性ph或生理ph)，并在细胞内隔室的ph下质子化，外节通过吞噬被细胞如rpe细胞吸收进入细胞内隔室中。当这样的染料吸附光子，产生激发的电子状态时，氨基的非共享电子对的电子转移到被激发所空出的轨道上。称为光致电子转移(pet)的这种电子转移阻止激发的分子免于发射转变，因此染料的荧光被淬灭。氨基的质子化改变了电子对的轨道的性质和能量，并终止了pet。结果，荧光报道分子部分响应于ph的改变。因为氨基的质子化消除了淬灭，所以基于pet的传感器变成随着ph降低而发出更强的荧光。
7、在某些实施方案中，荧光染料是基于罗丹明的对ph敏感的染料，如wo 2005/098437中所述。这些染料具有通过-oh或-sh(或其去质子化形式)而被邻位取代成呫吨部分的苯环。这些染料表现出类似于胺pet指示剂的ph-依赖性，但基于对ph传感器的感知需要，其被设计为具有小于6的pka值，所述ph传感器将靶向ph小于6的细胞隔室。
8、在另一个示例性实施方案中，荧光标志物是对ph敏感的荧光纳米颗粒。对ph敏感的荧光纳米颗粒主要使用与小分子对ph敏感的染料缀合的聚合物(srikun,d.,j.chem.sci.2011,2,1156；benjaminsen,r.v.,acs nano 2011,5,5864；albertazzi,l.,j.am.chem.soc.2010,132,18158；urano,y.,nat.med.2009,15,104)或使用对ph敏感的接头来缀合对ph不敏感的染料(li,c,adv.fund.mater.2010,20,2222；almutairi,j.am.chem.soc.2007,130,444)。为了进一步说明，wo 2013152059描述了可调节成适用于本测定中的ph可调、可高度活化的多色荧光纳米平台。
9、因此，本文在一个方面中提供了用于评估吞噬活性的方法，其包括将细胞与感光细胞外节(pos)孵育足以使细胞吞噬pos的时间和温度，其中pos在酸性ph下比在更高ph下发出更强的荧光，并检测孵育后细胞的荧光强度，其中与对照相比荧光增加指示细胞对pos的吞噬。
10、在一些实施方案中，细胞与pos在约室温至约37℃或约室温至约40℃的温度范围下孵育。在一些实施方案中，细胞与pos在约室温、约生理温度或约37℃下孵育。
11、在一些实施方案中，对照是与pos在低于室温下孵育的细胞。在一些实施方案中，对照是与pos在4℃下孵育的细胞。
12、本文还提供了用于评估贴壁细胞群中的吞噬活性的方法，其包括将贴壁细胞群与感光细胞外节(pos)孵育足以使细胞群中的细胞吞噬pos的时间和温度，其中pos在酸性ph下比在更高ph下发出更强的荧光，并且检测孵育后细胞群的荧光强度，其中与对照相比荧光的增加指示细胞对pos的吞噬。
13、在一些实施方案中，贴壁细胞群与pos在约17-40℃、或约25-40℃，或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。在一些实施方案中，对照是与pos在约10-16℃的温度下孵育的细胞群。在一些实施方案中，对照是与pos在约12-15℃的温度下孵育的细胞群。
14、本文还提供了用于评估吞噬活性的方法，包括提供用荧光标记标记的感光细胞外节(pos)，当通过吞噬内化进入细胞的低ph隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号；将测试细胞与标记的pos在允许吞噬标记的pos的条件下孵育；并检测与标记的pos孵育后测试细胞中改变的荧光(如果有的话)，并由此定量测试细胞的吞噬活性。
15、在一些实施方案中，改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低ph隔室时)是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。在一些实施方案中，通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低ph隔室时)。在一些实施方案中，改变的荧光信号将通过吞噬内化的标记的pos和结合在测试细胞表面但未内化的标记的pos区分开。在一些实施方案中，将在测试细胞中检测到的改变的荧光信号与用标记的pos孵育的对照细胞群进行比较以定量测试细胞的吞噬活性。
16、在一些实施方案中，测试细胞与标记的pos在约室温、约生理温度、约37℃、约15-40℃、或者室温至37℃、或者室温至40℃孵育。
17、在一些实施方案中，对照细胞群与标记的pos在低于室温(包括约4℃)下孵育。
18、还提供了用于评估吞噬活性的方法，包括提供用荧光标记标记的感光细胞外节(pos)，当通过吞噬内化进入细胞的低ph隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号；将贴壁的测试细胞与标记的pos在允许吞噬标记的pos的条件下孵育；并检测与标记的pos孵育后贴壁测试细胞中改变的荧光(如果有的话)，并由此定量贴壁测试细胞的吞噬活性。
19、在一些实施方案中，将测试细胞与pos在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将在贴壁测试细胞中检测到的改变的荧光信号与在保持细胞活力但仍然诱导低吞噬或不吞噬的温度下与标记的pos孵育的对照细胞群进行比较，任选地，这样的温度范围可以为从约12-15℃，以定量测试细胞的吞噬活性。在一些实施方案中，对照细胞群与pos在约10-16℃的温度下孵育。
20、本文还提供了用于评估测试细胞群的吞噬活性的标记的感光细胞外节(pos)制剂，所述pos用荧光标记标记，当通过吞噬内化进入细胞的低ph隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号。在一些实施方案中，改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低ph隔室时)是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。在一些实施方案中，通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号(当标记通过吞噬内化进入低ph隔室时)。在一些实施方案中，荧光标记是red。在一些实施方案中，pos用red和red e.coli bioparticles标记。
21、本文还提供用于测量细胞群中的吞噬活性的方法，其包括测量与非fitc荧光标记的感光细胞外节(pos)接触的测试细胞群中的测试荧光，并将测量的测试荧光与对照荧光进行比较，其中非fitc荧光标记的pos在酸性ph下发荧光但在较高ph下不发荧光或发出最低限度的荧光。
22、在一些实施方案中，测试细胞群与非fitc荧光标记的pos在约室温至约生理温度包括例如约37℃(即约室温至约37℃)或约室温至约40℃的温度范围下接触。在一些实施方案中，使测试细胞群与非fitc荧光标记的pos在约15-40℃或约生理温度(包括例如约37℃)的温度下接触。在一些实施方案中，对照荧光是与非fitc荧光标记的pos在低于室温下接触的细胞群的荧光。在一些实施方案中，对照荧光是与非fitc荧光标记的pos在4℃下接触的细胞群的荧光。
23、本文还提供了用于测量贴壁细胞群中的吞噬活性的方法，包括测量与非fitc荧光标记的感光细胞外节(pos)接触的贴壁测试细胞群中的测试荧光，并将测量的测试荧光与对照荧光进行比较，其中所述非fitc荧光标记的pos在酸性ph下发荧光但在较高ph下不发荧光或发出最低限度的荧光。
24、在一些实施方案中，降测试细胞群与非fitc荧光标记的pos在约17-40℃、约25-40℃、约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下接触。
25、在一些实施方案中，对照荧光是与非fitc荧光标记的pos在约12-15℃的温度下接触的贴壁细胞群的荧光。在一些实施方案中，对照荧光是与非fitc荧光标记的pos在约10-16℃的温度下接触的贴壁细胞群的荧光。
26、本文还提供了用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与用red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(pos)在约室温至约生理温度包括例如约37℃、或约室温至约40℃的温度范围下孵育的细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与用red染料标记的荧光标记的pos在低于室温下孵育的细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
27、本文还提供用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与用red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(pos)孵育的贴壁细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与用red染料标记的荧光标记的pos孵育的贴壁细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
28、在一些实施方案中，贴壁细胞群的第一等分试样与标记的pos在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育。在一些实施方案中，贴壁细胞群的第二等分试样与标记的pos在约10-16℃或12-15℃的温度范围下孵育。
29、本文还提供了用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与仅用red标记的感光细胞外节(pos)或用red和red e.coli bioparticles标记的感光细胞外节(pos)在约室温至约生理温度包括37℃、或约室温至约40℃的温度范围下孵育的细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与仅用red标记的感光细胞外节(pos)或用red和red e.coli bioparticles标记的感光细胞外节(pos)在低于室温包括4℃下孵育的细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
30、本文还提供用于测量吞噬活性的方法，其包括(1)测量与仅用red标记的感光细胞外节(pos)或用red和red e.coli bioparticles标记的感光细胞外节(pos)在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下、或约37℃的温度下孵育的贴壁细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与仅用red标记的感光细胞外节(pos)或用red和red e.colibioparticles标记的感光细胞外节(pos)在约10-16℃或约12-15℃的温度范围下孵育的贴壁细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。
31、各种实施方案同样适用于上述任何和所有方面。这些在下面叙述。
32、在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群与pos在约室温、在约生理温度、或约37℃、或约室温至约40℃、或约室温至约37℃、或约15-40℃下孵育。在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群与标记的pos在约17-40℃、或约25-40℃、或约34-40℃的温度范围下或在约37℃的温度下孵育。
33、在一些实施方案中，将对照细胞、对照细胞群、对照测试细胞或对照测试细胞群与pos在低于室温的温度、约10-16℃或约12-15℃的温度范围或约4℃的温度下孵育。
34、在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群包含视网膜色素上皮(rpe)细胞。在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群包含感光祖细胞。在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群是人细胞。
35、在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群是通过多能干细胞的体外分化产生的。
36、在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群是冷冻保存和在使用之前解冻的。
37、在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群作为汇合的单层提供。
38、在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群在使用前被酶消化。
39、在一些实施方案中，细胞、细胞群、测试细胞或测试细胞群作为贴壁细胞群提供。
40、在一些实施方案中，pos是破碎的pos。在一些实施方案中，pos是超声波化的pos。
41、在一些实施方案中，荧光标记是red。因此，在一些实施方案中，pos用red染料标记。在一些实施方案中，pos用red和rede.coli bioparticles标记。在一些实施方案中，将细胞与red标记的pos和red e.coli bioparticles孵育。
42、在一些实施方案中，通过流式细胞术检测荧光。在一些实施方案中，使用酶标仪检测荧光。
43、在一些实施方案中，将细胞与pos孵育约15-30小时，或16-20小时，或20-28小时。
44、在一些实施方案中，细胞作为细胞培养物提供。在一些实施方案中，细胞是汇合的细胞培养物。
45、应该理解，测试和对照细胞可以是相同细胞群的不同等分试样。
46、在另一方面，本公开提供了分离的细胞群，其特征在于其感光细胞外节(pos)的吞噬率比相等数量的原代细胞的pos的吞噬率高至少50％。在一些实施方案中，细胞群是rpe细胞群。在一些实施方案中，细胞群是通过多能干细胞的体外分化而获得的rpe细胞群，而原代细胞是来自分离的成年眼的rpe细胞。在一些实施方案中，细胞群是感光祖细胞。
47、这些和各种其他方面和实施方案将在本文中更详细地描述。
1.用于测量吞噬活性的方法，包括：
2.用于测量吞噬活性的方法，包括：
3.确定细胞群是否适于治疗视网膜变性疾病的方法，包括：
4.确定细胞群是否适于治疗视网膜变性疾病的方法，包括：
5.确定细胞群是否适于治疗视网膜变性疾病的方法，包括：
6.通过多能干细胞的体外分化产生的细胞群，
7.权利要求6的细胞群，其中细胞群的pos和/或细菌片段的吞噬率比相等数量的衍生自眼睛供体的rpe细胞或感光祖细胞的pos和/或细菌片段的吞噬率高至少75％、100％、150％或200％。
8.通过多能干细胞的体外分化产生的细胞群，
9.权利要求8的细胞群，其中24小时后细胞群吞噬pos和/或细菌片段的总浓度的至少25％、30％、40％或50％。
10.组合物，其包含权利要求6或8的细胞群。
