本发明属于微生物学中的细菌染色技术，特别是涉及一种有机溶剂预处理的革兰氏染色方法，用于提高革兰氏染色的准确性和区分度。
背景技术：
1、在微生物学研究领域中，革兰氏染色法是一种基础性技术，用于区分不同类型的细菌。该方法首先涉及使用结晶紫染液对细胞进行初步染色，随后碘液作为媒染剂，以促进结晶紫在细胞壁内与碘形成与水不溶的复合物。不同细菌之间肽聚糖层的交联程度差异成为了显著的区分指标。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，能够有效地固定结晶紫着色，而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层较薄，使得结晶紫在后续的洗脱过程中被移除。这一差异是通过有机溶剂(如乙醇或丙酮)作为脱色剂实现的，其对细胞壁的影响是区分这两类细菌的关键。
2、尽管革兰氏染色法在理论上能够有效区分革兰氏阳性和阴性细菌，但实际操作过程中存在一定的挑战，尤其在控制洗脱步骤的准确性上。不精确的时间控制可能导致阴性菌假阳性的结果，使阴性菌可能被错误地染成紫色，从而与阳性菌混淆。当涉及到肽聚糖层较薄的阳性菌时，这一问题尤为显著，因为它们的染色特性可能与阴性菌相似，使得区分变得更加困难。这表明在进行革兰氏染色时，对洗脱时间的精确控制至关重要，以确保实验结果的可靠性和准确性。
3、在革兰氏染色法的应用过程中，不同研究小组已经尝试了多种方法来优化染色过程并解决常见问题。例如，通过延长脱色时间和使用适当浓度的复染液，有效地减少了革兰氏阴性菌被染色导致的假阳性问题。此外，使用0.4％的碱性复红乙醇溶液同时完成褪色和复染，从而提高了染色效果。标本的固定方法也是影响染色效果的关键因素。传统方法中常采用加热固定标本的方式，但这种方法可能导致细菌在高温下被烧毁。为了改进这一问题，有研究提出使用紫外照射来固定标本，从而减少细菌形态的固定问题的情况，但是创造对操作者无害的紫外环境技术要求高，难度大，并且紫外照射时间长，有悖于革兰氏染色法的便捷性。
4、cn108663253a公开了一种快速进行革兰氏染色的方法，革兰氏a液：a液：结晶紫1g、95％酒精20ml、b液：草酸铵0.8g蒸馏水80ml；革兰氏b液：碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml、革兰氏c液：无水乙醇95ml、蒸馏水5m、革兰氏d液：沙黄0.25g、碱性品红0.1g、95％酒精10ml、蒸馏水90ml；该方法染色时间短，用于快速进行诊断和鉴别革兰氏阳性菌和阴性菌，但实际染色效果不好。
技术实现思路
1、基于上述内容，本发明的目的是提供一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，旨在解决现有技术中因洗脱步骤控制不精确而导致的革兰氏阴性菌假阳性问题，提高细菌染色的分辨率和准确度并增强革兰阳性和阴性细菌之间的区分度。
2、革兰氏染色的原理在于，革兰氏阳性细菌较厚的肽聚糖层能够有效固定结晶紫染料，而革兰氏阴性细菌较薄的肽聚糖层在随后的洗涤过程中会将结晶紫染料去除。脱色剂对细胞壁染料的影响是区分这两类细菌的关键。乙醇对革兰氏阴性细菌的细胞壁产生影响，损害其结构并降低染色程度。这一原理已被广泛研究。
3、基于细菌细胞壁分子结构的原理，本发明提供了一种改进的革兰氏染色方法——有机溶剂(乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇等)预处理染色法。核心步骤是在细菌液体固定后使用上述有机溶剂进行预处理。这一步主要针对革兰氏阴性细菌，聚焦于其外膜脂质和薄的肽聚糖结构。利用上述有机溶剂预处理可以破坏革兰氏阴性细菌的脂质外膜，增加其肽聚糖层的多孔性，从而使结晶紫-碘复合物在随后的染色过程中更容易被洗脱，达到更有效的区分效果。
4、我们发现，革兰氏阴性细菌的外膜脂质和薄肽聚糖层是其染色特性的关键因素。传统的革兰氏染色方法主要依赖于染色和脱色步骤，但这些步骤对革兰氏阴性细菌的处理并不总是足够有效。通过分析细菌细胞壁的分子结构，本发明首次提出了利用有机溶剂进行预处理的概念，以增强染色的分辨率。具体来说，我们考虑到有机溶剂可以在染色前对细菌细胞壁产生预处理作用。乙醇等有机溶剂能够有效地溶解革兰氏阴性细菌的脂质外膜，并增加其肽聚糖层的多孔性。这一处理过程使得结晶紫-碘复合物在革兰氏阴性细菌中更容易被洗脱，从而避免了假阳性结果的出现。此外，这种预处理还能够使革兰氏阳性细菌中的染色复合物更加紧密地结合于其细胞壁，进一步提高染色的准确性和区分度。
5、本发明提出了一种基于传统革兰氏染色法核心原理的改良方法，在传统革兰氏染色法的基础上，先利用有机溶剂对细菌进行预处理，再进行后续操作。本发明使用的有机溶剂(如乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇等)可以溶解革兰氏阴性细菌的脂质外膜并增加其细胞壁的多孔性，导致结晶紫-碘复合物从薄的肽聚糖层中被洗去，使细菌失去紫色染色；而这些有机溶剂在革兰氏阳性细菌中起脱水作用，使结晶紫-碘复合物紧密结合于其肽聚糖层中。利用上述有机溶剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌不同的作用效果，经有机溶剂预处理后再进行染色，使得革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌分别达到不同的染色状态，避免了阴性菌假阳性问题，从而提高了革兰氏染色法的准确性和效果。
6、本发明的目的采用以下技术方案实现：
7、一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，包括以下步骤：
8、a.制备细菌的染色涂片；
9、b.对染色涂片进行有机溶剂预处理；
10、c.在预处理后的染色涂片上进行结晶紫初染；
11、d.水洗结晶紫染色后的涂片；
12、e.用碘液处理涂片；
13、f.用有机溶剂脱色涂片；
14、g.对涂片进行复红染色；
15、h.调整显微镜参数，观察染色结果。
16、进一步地，在制备细菌染色涂片前，先对细菌进行培养，包括以下步骤：
17、(1)细菌活化培养：根据具体菌种将细菌接种到适合的液体培养基中，并在适宜温度下进行前培养。具体的菌种包括但不限于芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、大肠杆菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属。培养条件根据具体菌种的生长特性进行调整，一般选择各菌种最适宜的生长条件，例如温度范围为25～37℃，ph为5-7。
18、(2)细菌扩大培养：将前培养的菌液转移到适宜温度和摇床条件下继续培养，以获得对数生长期的细菌。培养时间和条件根据具体菌种的生长特性进行调整，一般选择各菌种最适宜的生长条件，例如过夜培养12-16小时，一般都是按照常规的活化时间进行培养，例如大肠杆菌的培养时间是15小时。
19、进一步地，步骤a中，制备细菌染色涂片的具体操作为：在洁净载玻片上点样细菌悬液，每次滴加2-5μl，混合均匀涂制成菌斑。2-5μl的点样量可以快速行成菌斑，如果滴加太多的话可能要很久才能形成干燥的菌斑，可能造成环境的污染。对照组和改良组菌斑可以在同一载玻片上，间距适当以防交叉污染。为防止操作失误，可在载玻片上标记区域。
20、进一步地，步骤b中，对染色涂片进行有机溶剂预处理的具体操作为：在菌斑处点加体积分数为70％～100％的有机溶剂数滴于涂片数滴以全部覆盖菌斑，待溶剂自然挥发(1～3分钟)。所述有机溶剂可以是乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇或其组合。该预处理步骤适用于各种革兰氏阳性和阴性细菌，以增强染色对比度和准确性。有机溶剂的处理时间可以根据细菌类型和实验目的进行调整，例如延长处理时间以确保溶剂充分渗透细胞壁。
21、进一步地，步骤c中，结晶紫初染的具体操作为：有机溶剂挥发后，在涂片上点加浓度为0.002-0.005g/ml的结晶紫染色液以全部覆盖菌斑，染色时间为1～2分钟。
22、进一步地，步骤d中，水洗结晶紫染色后的涂片的具体操作为：轻轻倾斜载玻片，用纯化水冲洗染色区域，直至冲去黑色或紫色絮状物。
23、进一步地，步骤e中，碘液处理涂片的操作步骤为：将浓度为0.002-0.005g/ml的碘液滴于涂片上覆盖菌斑，作用30-90秒。轻轻倾斜载玻片，用纯化水冲洗，注意避免过度冲洗而冲失细胞。
24、进一步地，步骤f中，有机溶剂脱色涂片的具体操作为：点加体积分数为70％～100％的有机溶剂数滴于涂片，轻摇30～60秒钟后水洗，用吸水纸吸去玻片边缘水分。所述有机溶剂包括乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇或其组合。
25、进一步地，步骤g中，对涂片进行复红染色的具体操作为：将复红染色液滴于涂片上覆盖菌斑，作用1-5分钟。如染色效果不佳，可适当延长至5分钟，然后用纯化水冲洗5～10秒。
26、复染溶液的种类和浓度也可以根据实验要求进行调整，例如使用浓度为0.001-0.005g/ml的沙黄复红染色液。
27、进一步地，步骤h中，利用显微镜观察染色结果的具体操作为：调整显微镜参数，包括亮度与对比度、饱和度、色调与增益、色温等，并轻甩干载玻片。拍照时选择视野清晰、细菌数量及分布适中的区域，并在5分钟内完成拍照以防红色染料褪色。
28、与现有技术相比，本发明具有如下的优点与有益效果：
29、(1)本发明提供了一种改良的革兰氏染色方法，通过有机溶剂(如乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇等)预处理增强革兰氏阴性细菌细胞壁的多孔性，减弱了结晶紫的结合，同时也促进了结晶紫-碘复合物的有效洗脱。这种预处理步骤显著提升了革兰阳性菌与阴性菌的染色对比度和区分度，提高了细菌识别的准确性，使染色过程更为标准化和可重复，从而提高染色的准确性和效果。
30、(2)本发明提供的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，具有一定的普适性，适用于不同类型的革兰氏阳性和阴性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、大肠杆菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属。所述有机溶剂均为通过市售购买得到的常规溶剂，如乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇等，可以是单一溶剂，也可以是多种溶剂的组合，具体选用取决于实验要求和菌种特性。
31、(3)本发明所述染色涂片适用于不同培养条件下的细菌，包括新鲜取样的细菌、不同生长期的细菌及实验室培养的细菌。
32、(4)本发明提供的一种利用有机溶剂预处理的革兰氏染色方法，优化了染色流程，减少操作差异影响，简便高效，适用于细菌鉴定和快速诊断。
1.一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，在制备细菌染色涂片前，先对细菌进行培养，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤a中，制备细菌染色涂片的具体操作为：在洁净载玻片上点样细菌悬液，每次点样量为2-5μl，混合均匀涂制成菌斑。
4.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤b中，对染色涂片进行有机溶剂预处理的具体操作为：在菌斑处点加体积分数为70％～100％的有机溶剂数滴以全部覆盖菌斑，待溶剂自然挥发。
5.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤c中，结晶紫初染的具体操作为：有机溶剂挥发后，在涂片上点加浓度为0.002-0.005g/ml的结晶紫染色液以全部覆盖菌斑，染色时间为1～2分钟。
6.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤d中，水洗结晶紫染色后的涂片的具体操作为：轻轻倾斜载玻片，用纯化水冲洗染色区域，直至冲去黑色或紫色絮状物。
7.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤e中，碘液处理涂片的操作步骤为：将浓度为0.002-0.005g/ml的碘液滴于涂片上覆盖菌斑，作用30-90秒，轻轻倾斜载玻片，用纯化水冲洗。
8.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤f中，有机溶剂脱色涂片的具体操作为：点加体积分数为70％～100％的有机溶剂数滴于涂片，轻摇30～60秒钟后水洗，用吸水纸吸去玻片边缘水分；所述有机溶剂包括乙醇、丙酮、甲醇、异丙醇或其组合。
9.根据权利要求1所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤g中，对涂片进行复红染色的具体操作为：将复红染色液滴于涂片上覆盖菌斑，作用1-5分钟，然后用纯化水冲洗。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种提升染色分辨率的有机溶剂预处理革兰氏染色法，其特征在于，步骤h中，利用显微镜观察染色结果的具体操作为：调整显微镜参数，包括亮度与对比度、饱和度、色调与增益、色温等，并轻甩干载玻片；拍照时选择视野清晰、细菌数量及分布适中的区域，并在5分钟内完成拍照。
