本发明涉及生物，尤其涉及非天然氨基酸、其对应氨酰trna合成酶及其所构蛋白ros响应调控体系。
背景技术：
1、蛋白质是生命体内重要的组成部分，其活性的调控具有普遍而重要的意义。近些年来，已经发展出多种蛋白调控手段，例如利用非共价相互作用的蛋白二聚激活，非共价小分子激动剂或抑制剂以及利用泛素-蛋白酶体系统降解靶蛋白的小分子探针等，又或者是各类通过条件相应的共价连接来调节蛋白活性的策略，如融合表达，共价化学修饰等。在这些方法中，蛋白特定位置的化学修饰可以打破天然20种氨基酸的限制。将响应特定条件的化学基团引入蛋白质上，实现特定条件对蛋白的活性调控，极大发展了可用于诸如靶向治疗，生物传感以及作为其它功能的分子工具。然而，传统的化学修饰由于其主要利用天然活性残基进行偶联，其修饰的基团数量和位置都具有随机性，给蛋白质活性的精准调控造成了很大阻碍。基因密码子扩展技术(genetic code expansion,gce)为这一问题提供了解决方案，通过引入与生物体正交的氨酰trna合成酶(aminoacyl-trnasynthetase，aars)及其对应的trna，可利用以tag为主的无义密码子给特定蛋白带上20种蛋白编码氨基酸以外的非天然氨基酸(noncannonical amino acids,ncaas)，实现蛋白质特定位置的精准修饰。由于其产生定点修饰蛋白方面的优势，基因密码子扩展技术已经广泛被用于蛋白质活性的调控，目前已经开发出一系列可以响应光照或者化学断键反应的非天然氨基酸脱笼反应并已成功应用于各类蛋白活动的人工调控。然而，大多数研究都依赖于人工给予的外界信号，但作为生理状态指标的内源信号目前却少被关注，存在着巨大的空白。
2、在体内诸多内源信号中，活性氧ros是一类高反应性小分子，其在生理和病理发生中扮演着重要的角色。各类ros主要产生于线粒体的电子传递链或是原核质膜上的氧化反应，也可产生于其它途径例如巨噬细胞活化产生的呼吸爆发或者nadph氧化酶(nox)、黄嘌呤氧化酶(xo)和未偶联的内皮一氧化氮合酶(enos)等氧化酶。ros在体内广泛参与各种生命进程和信号通路，参与维持着细胞的正常功能。在生理情况下机体内的ros水平受到严格调控，但在一些异常状态中，激活的免疫反应，受损的线粒体或一些酶活性的异常增强可导致局部ros水平的升高。例如在肿瘤中，由于代谢状态发生改变，因此多种癌细胞内源及其微环境的ros水平高于正常细胞。此外由于某些氧化酶的过表达，一些癌细胞还可以被小分子药物诱导进一步产生更多ros。除肿瘤外，ros在诸如炎症，神经退行性疾病等病灶都会显示出高水平积累,显示出其作为疾病诊断和治疗靶标的优秀属性。从传统开发可影响ros水平的小分子药物来进行相应的治疗，到现今利用ros作为响应调控的条件来实现对疾病的成像或响应治疗，ros靶向的价值逐渐被人们所认可。目前靶向ros的各种策略中，主要是用于成像或治疗的ros响应小分子及响应微环境ros进行给药的载体或材料，而直接针对蛋白质的ros调控却几乎未被探索，先前有研究利用化学修饰的方式对目标蛋白进行活性封闭，实现ros的响应激活，但这种方法受蛋白自身影响较大，单一方法的适用范围小，即受到化学修饰方法本身的限制。因此，利用基因密码子扩展技术来实现ros对蛋白活性的调控是解决这一问题的有效手段。
3、此前有研究报道过含ros响应硼酸基团的非天然氨基酸。2008年，有研究报道了一种含有苯硼酸结构的酪氨酸衍生物p-boronophenylalanine(bpa)并实现了其在原核体系的插入。在2021年，有研究在对表达系统和gfp探针进行大量优化后实现了利用bpa对内源产生ros的成像。此后，在2023年，另一篇文章利用此氨基酸，在借助光敏剂的条件下实现了bpa对affibody亲和能力的光控调节。虽然bpa具有ros响应能力，但其后续的应用却十分受限。
4、体内诸多内源信号中，活性氧(ros)是非常重要一类高反应性小分子，
5、其广泛参与多种疾病状态，显示出其作为疾病诊断和治疗靶标的优秀属性。
6、开发出一种通用的能够靶向ros进行激活的蛋白调控策略是很有必要的。
7、然而，利用ros来调控蛋白活性还存在着诸多困难，目前有少数研究利用化学修饰的方法给蛋白质带上ros“开关”但其严格受到蛋白本身性质的限制。而现有依靠基因密码子扩展技术在实现蛋白活性的ros调控方面也少有探索。可以说现今并没有一种通用便于使用的利用ros调控蛋白活性的体系。
8、现有技术实现ros相应的蛋白质活性调控主要依靠将ros反应基团引入蛋白活性位置，引入有两种方法，一种是化学随机修饰，其缺点是：
9、1.修饰的基团在数量和位置上都较为随机，仅能应用在特定的少量蛋白上，难以推广使用。
10、另一种是基于基因密码子扩展技术将ros活性基团定点定量的引入蛋白表面，先前仅有一个对硼酸基苯丙氨酸p-boronophenylalanine(bpa)作为ros活性基团被遗传编码到蛋白上，但其缺乏作为一种通用ros调控元件的性质，原因有下：
11、1.其响应ros生成的酪氨酸与其本身结构较为相似，仅靠硼酸基团封闭蛋白活性效果很差。
12、2.酪氨酸骨架在各种蛋白参与活性的频率很低，因此难以作为封闭蛋白活性的位点。
13、3.相比原核系统，其在真核系统进行使用时需要用不同物种来源的氨酰trna合成酶和特别优化过的真核表达体系，这使得应用范围十分受限。
14、4.目前已发表它响应内源ros的应用仅限于ros成像，还没有利用内源ros进行蛋白活性调控的应用。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了非天然氨基酸、其对应氨酰trna合成酶及其所构蛋白ros响应调控体系。本发明提供的非天然氨基酸能够将ros活性基团定点定量的引入蛋白表面，具有通用性和普适性，基因密码子扩展可以在任何蛋白的任何位置以生物遗传编码的方式引入ros“开关”。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、非天然氨基酸，其特征在于，其具有式i所示的结构，或其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药或其硼酸酯形式；
4、
5、其中，ra、rb、rc、rd、re、rf独立地选自：氢、苯基、卤素、c1-c7烷基、c1-c7卤代烷基、c1-c7烷氧基、c1-c7烷氧基、c1-c7叠氮基、c1-c7烷酰基或c1-c7炔基、叠氮基或取代苯基；
6、所述取代苯基中的取代基独立地选自：c1-c7烷基、c1-c7烷氧基、c1-c7叠氮基、c1-c7烷酰基或c1-c7炔基；
7、rb和rc成环或不成环；
8、所述rb、rc成环时，rb、rc与它们连接的原子形成4～8元杂环基；
9、所述非天然氨基酸为l型或d型。
10、一些实施方案中，所述非天然氨基酸具有式ii或式iii所示的结构：
11、
12、
13、其中，ra、rd、re、rf的结构如权利要求1所述；所述非天然氨基酸为l型或d型。
14、一些具体实施例中，所述非天然氨基酸具有如下任一结构：
15、
16、本发明中，式iv所示的非天然氨基酸简称kbo。
17、本发明还提供了所述的非天然氨基酸在制备重组蛋白中的应用。
18、本发明还提供了重组蛋白，其野生型蛋白的序列中至少一个位点上的氨基酸突变为本发明所述的非天然氨基酸。
19、一些实施方案中，所述非天然氨基酸采用基因密码子拓展技术定点引入到所述野生型蛋白中。
20、本发明所述的重组蛋白中，其野生型蛋白包括具有治疗或预防疾病作用的功能性蛋白、诊断蛋白、重组病毒的功能蛋白等，包括但不限于：重组抗体、抗体药物偶联蛋白、重组功能性酶、重组细胞因子、重组毒素蛋白、重组荧光蛋白、具有结合或催化功能的重组蛋白、重组多肽类药物、病毒衍生的递送载体、其它蛋白递送载体等。
21、重组病毒的功能蛋白是指蛋白结构上插入kbo的重组病毒，例如衣壳蛋白上插入kbo的aav2重组病毒，可由真核细胞生产。
22、本发明还提供了氨酰化trna合成酶突变体，其野生型氨酰化trna合成酶的第96位、第229位、第230位、第223位或第235位的至少一个氨基酸被取代。
23、本发明中，所述野生型的氨酰化trna合成酶来源于methanomethylophilusalvus，所述野生型的氨酰化trna合成酶的氨基酸序列如seq id no:1所示，其核酸序列如seq id no:2所示。
24、进一步的，所述取代包括m96f、l229i、h233w、l229g、d230e、h233c、v235p中的至少一种。
25、本发明还提供了编码所述氨酰化trna合成酶突变体的核酸。
26、一些具体实施例中，编码所述氨酰化trna合成酶突变体的核酸，具有：
27、a)如seq id no：4或seq id no：6所示的核苷酸序列；或
28、b)在a)所示的核苷酸序列中缺失、取代或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与a)相同或相似；或
29、c)与a)或b)所示序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
30、一些具体实施例中，本发明所述的氨酰化trna合成酶突变体包括突变体xe4rs和突变体2g6rs，所述突变体xe4rs包括m96f、l229i、h233w的位点突变，其氨基酸序列如seqid no:3所示，其核苷酸序列如seq id no:4所示；所述突变体2g6rs包括l229g、d230e、h233c和v235p的位点突变，其氨基酸序列如seq id no:5所示，其核苷酸序列如seq id no:6所示。
31、本发明还提供了靶向ros激活的蛋白调控体系，包括氨酰化trna合成酶或其突变体，以及本发明所述的非天然氨基酸。
32、本发明还提供了如下任一项在蛋白调控或制备ros响应的重组病毒中的应用；
33、1)本发明所述的非天然氨基酸；
34、2)引入本发明所述非天然氨基酸的重组蛋白；
35、3)本发明所述的氨酰化trna合成酶突变体；
36、4)本发明所述的蛋白调控体系；
37、所述蛋白调控包括调控酶活性、蛋白-蛋白相互作用、病毒侵染能力、信号肽定位能力、穿膜肽穿膜活性、蛋白荧光发生中的至少一种。
38、一些实施方案中，本发明提供了利用本发明非天然氨基酸对病毒侵染能力进行调控的方法，包括：
39、将病毒载体上负责与细胞表面抗原结合的赖氨酸突变为本发明所述的非天然氨基酸，病毒失去侵染细胞的能力；
40、向上述反应体系中加入ros激活剂，病毒恢复侵染能力。
41、一些具体实施例中，所述病毒载体为重组aav2载体。进一步的，将所述重组aav2载体上585位点的赖氨酸突变为本发明所述的非天然氨基酸kbo。
42、本发明所述的非天然氨基酸(如kbo)能够响应ros释放天然赖氨酸，从而恢复病毒的侵染能力。其中，所述ros的激活剂包括onoo-donor和/或过氧化氢。
43、本发明还提供了ros响应的重组病毒，所述重组病毒包含病毒载体，所述病毒载体上负责与细胞表面抗原结合的赖氨酸突变为本发明所述的非天然氨基酸。
44、本发明还提供了向蛋白中定点引入非天然氨基酸的方法，包括：
45、步骤1)：构建含编码目的蛋白的基因的表质粒1，以及携带氨酰化trna合成酶或其突变体的编码基因以及对应trna的编码基因的质粒2，将所述质粒1和质粒2共转化或共转染至宿主；
46、步骤2)：向培养体系中添加权利要求1～3任一项所述的非天然氨基酸，培养，诱导宿主表达后进行分离纯化，获得包含所述非天然氨基酸的重组蛋白。
47、其中，所述宿主包括原核生物和真核生物；所述原核生物包括大肠杆菌；所述真核生物包括酵母、各类型人类和哺乳动物细胞。
48、本发明提供式i结构的非天然氨基酸可响应活性氧，作为基因密码子扩展技术的重组氨酰trna合成酶底物，高效、定点的引入到蛋白的任意位点，具有通用性和普适性。该非天然氨基酸利用基因密码子扩展体系插入到蛋白表面可以在任何蛋白的任何位置以生物遗传编码的方式引入ros“开关”。本发明还提供了氨酰trna合成酶突变体，可实现本发明所述非天然氨基酸在蛋白上的遗传编码，并具有较高的插入效率，其可直接用于真核和原核，无需额外的序列修饰或修改，简单便捷。相比现有技术，本发明存在如下优势：
49、1.相比随机修饰，本发明提供的非天然氨基酸能够将ros活性基团定点定量的引入蛋白表面，具有通用性和普适性，基因密码子扩展可以在任何蛋白的任何位置以生物遗传编码的方式引入ros“开关”。
50、2.相比对硼酸基苯丙氨酸bpa，本发明非天然氨基酸kbo中，苯硼酸基团封闭的赖氨酸，较大体积苯硼酸基团带来的位阻可以有效用于各种蛋白接触面或口袋的封闭。
51、3.相比非天然氨基酸bpa，赖氨酸生理条件下作为正电氨基酸，其广泛参与各类生命活动，因此适用性明显更加广泛，响应ros释放天然赖氨酸的kbo具有更加广阔的应用范围。
52、4.相比非天然氨基酸bpa，本发明提供的氨酰trna合成酶突变体xe4rs，可高效地将kbo插入到目标蛋白中，直接用于真核和原核，无需额外做序列的任何修改，非常便捷。
53、5.相比非天然氨基酸bpa，本发明所开发非天然氨基酸kbo和xe4rs突变体的基因密码子扩展体系以及成功用于酶活性调控，蛋白-蛋白相互作用调控和病毒侵染能力调控。
1.非天然氨基酸，其特征在于，其具有式i所示的结构，或其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药或其硼酸酯形式；
2.根据权利要求1所述的非天然氨基酸，其特征在于，所述非天然氨基酸具有式ii或式iii所示的结构：
3.根据权利要求1或2所述的非天然氨基酸，其特征在于，其具有如下任一结构：
4.权利要求1～3任一项所述的非天然氨基酸在制备重组蛋白中的应用。
5.重组蛋白，其特征在于，其野生型蛋白的序列中至少一个位点上的氨基酸突变为权利要求1～3任一项所述的非天然氨基酸。
6.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于，所述非天然氨基酸采用基因密码子拓展技术定点引入到所述野生型蛋白中。
7.根据权利要求5或6所述的重组蛋白，其特征在于，所述野生型蛋白包括具有治疗或预防疾病作用的重组抗体、抗体药物偶联蛋白、重组功能性酶、重组细胞因子、重组毒素蛋白、重组荧光蛋白、具有结合或催化功能的重组蛋白、重组多肽类药物或病毒衍生的递送载体。
8.氨酰化trna合成酶突变体，其特征在于，其由野生型氨酰化trna合成酶发生m96f、l229i、h233w、l229g、d230e、h233c、v235p中至少一种位点突变获得。
9.根据权利要求8所述的氨酰化trna合成酶突变体，其特征在于，其野生型的氨酰化trna合成酶来源于methanomethylophilus alvus，所述野生型的氨酰化trna合成酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
10.编码权利要求8或9所述氨酰化trna合成酶突变体的核酸。
11.靶向ros激活的蛋白调控体系，其特征在于，包括氨酰化trna合成酶或其突变体，以及权利要求1～3任一项所述的非天然氨基酸。
12.根据权利要求11所述的蛋白调控体系，其特征在于，所述氨酰化trna合成酶突变体为权利要求8或9所述的氨酰化trna合成酶突变体。
13.如下任一项在蛋白调控或制备ros响应的重组病毒中的应用；
14.向蛋白中定点引入非天然氨基酸的方法，其特征在于，包括：
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述宿主包括原核生物和真核生物；
