本发明涉及生物基因工程，尤其涉及一种甘蓝型油菜干旱负调控基因bnac07.myb77的应用。
背景技术：
1、目前对甘蓝型油菜种质资源的耐旱性鉴定上已有大量的研究，通过综合使用多种耐旱性状的评价指标，挖掘出大量与干旱胁迫相关的候选基因。随着甘蓝型油菜全基因组数据的不断补充和完善，对甘蓝型油菜基因的耐旱功能研究也逐渐从理论推向实际。
2、microrna家族被认为一个比较保守的基因家族，li等(li j.,duan y.,sun n.,wang l.,feng s.,fang y.,wang y.the mir169n-nf-ya8 regulation module involvedin drought resistance in brassica napusl[j].plant science:an internationaljournal of experimental plantbiology,2021,313(1):111062.)的研究发现该家族中mir169能够结合nf-ya8基因调控甘蓝型油菜的耐旱性，通过在油菜中分别过表达mir169和nf-ya8基因，前者能够导致转基因油菜相对含水量以及脯氨酸含量上调，提高植株的抗氧化能力，后者也能提高植株对渗透胁迫的耐受性。della蛋白属于ga途径的关键蛋白，参与调控诸多非生物胁迫反应。wu等(wu j.,yan g.,duan z.,wang z.,kang c.,guo l.,liuk.,tu j.,shen j.,yi b.,fu t.,li x.,ma c.,dai c.roles of the brassica napusdella protein bnaa6.rga,in modulating drought tolerance by interacting withthe aba signaling component bnaa10.abf2[j].frontiers in plant science,2020,11(1):577)在甘蓝型油菜中发现四个rga基因参与编码della蛋白，其中bnaa6.rga基因能被干旱和aba诱导表达，通过构建该基因的敲除植株，发现其被aba处理后表现出气孔闭合的敏感性，保水能力更强，除此之外，该基因还可与aba信号通路的abf2基因互作，共同调控甘蓝型油菜的干旱耐受性。liang等(liangy.,kang k.,gan l.,ning s.,xiong j.,song s.,xi l.,lai s.,yin y.,gu j.,xiang j.,li s.,wang b.,lim.drought-responsivegenes,late embryogenesis abundant group3(lea3)and vicinal oxygen chelate,function in lipid accumulation in brassica napus and arabidopsis mainly viaenhancing photosynthetic efficiency and reducing ros[j].plant biotechnologyjournal,2019,17(11):2123-2142.)研究通过在油菜分别对lea3和voc基因进行超表达和干扰，发现lea3和voc参与作物的光合过程，并能降低ros积累，从而增加脂质积累，为甘蓝型油菜提高含油量和耐旱性奠定了基础。
3、除了在油菜本体中直接研究候选基因的耐旱性，还可以通过模式植物拟南芥异源表达油菜耐旱候选基因进行功能验证，加快实验进程。如liu等(liu l.,ding q.,liu j.,yang c.,chen h.,zhang s.,zhu j.,wang d.brassica napus col transcriptionfactor bncol2 negatively affects the tolerance of transgenic arabidopsis todrought stress[j].environmental and experimental botany,2020,178(1):104171.)在甘蓝型油菜中鉴定了一个能被nacl、peg和aba诱导表达的bncol2基因，通过在拟南芥中超表达该基因，发现转基因拟南芥在干旱处理后的存活率较对照低，蒸腾速率大叶温低，该基因还能抑制下游胁迫基因表达来负调控植株对干旱的耐受性。多种研究证明abf2已有其参与aba信号转导过程(kim et al.,2004)，zhao等(zhaob.y.,huy.f.,lij.j.,yaox.,liuk.d.bnaabf2,a bzip transcription factor from rapeseed(brassica napusl.),enhances drought and salt tolerance in transgenic arabidopsis[j].botanicalstudies,2016,57(1):12.)在甘蓝型油菜中克隆出该基因，并在拟南芥中过表达，发现过表达abf2基因的拟南芥能够降低失水速率，诱导胁迫响应基因表达，体现出明显的耐旱功能。研究发现lea蛋白在植物渗透胁迫起到十分重要的作用，通过在油菜中克隆出bnem6和bnem1两个编码lea蛋白基因，并构建过表达拟南芥株系，发现其对干旱胁迫以及盐胁迫都具有一定程度的耐受性，为胁迫下幼苗的根系发育提供了保护。王珍等(王珍.bnmapk1参与甘蓝型油菜干旱胁迫应答及生长发育进程的分子机理[d]；西南大学,2020)在mapks级联系统中发现mapk1可能参与响应干旱胁迫，便在油菜中克隆出该基因并在拟南芥中超表达，发现转基因拟南芥较野生型植株失水速率慢，对干旱的耐受性更强。由此可见，模式植物拟南芥加代快，转化率高的特点在验证油菜基因中起到了很大的帮助作用。
4、甘蓝型油菜因含油量高，产量高，耐湿、抗病等优良性状被广泛种植，目前已经是我国油菜栽培的主要品种。但甘蓝型油菜的生育期对水分的需求量大，对缺水干旱的抗性不佳，从而制约了其产量水平。随着油菜的生产面积逐渐扩大，一些地区土壤含水量低，雨量少，这对于油菜的生产构成了严峻的挑战。据其他学者的预测模型，未来的温室气候会给欧洲、北美洲以及亚洲等地区的油菜产量造成一定程度的降低，而且温度上升带来的干旱胁迫还会影响菜籽油的品质。特别是在油菜的营养生长以及生殖生长阶段，干旱会极大影响其正常发育。据统计，干旱发生在生殖生长期间对产量的影响比在营养生长阶段的大，且在整个生育时期，花期是油菜对水分最敏感的阶段。甘蓝型油菜在花期受到干旱胁迫，会导致油菜的主花序长度缩短，且有效分支数降低，直接限制了单株产量。除此之外，在种子的萌发期，干旱也会大大降低甘蓝型油菜的成苗率。朱小慧等(朱小慧.甘蓝型油菜种质抗旱评价与生理机制研究[d]；西北农林科技大学,2022)的研究发现，在种子的萌发期进行peg6000处理，随着peg6000浓度的加大，种子的发芽指数逐渐降低，且发芽的幼苗长势也受到明显的抑制。杨春杰等(杨春杰,张学昆,邹崇顺,程勇,郑普英,李桂英.peg-6000模拟干旱胁迫对不同甘蓝型油菜品种萌发和幼苗生长的影响[j].中国油料作物学报,2007,no.114(04):425-430.)的研究也发现peg6000处理下的甘蓝型油菜种子活力明显下降，幼苗鲜重和苗高也显著降低，但初生根长度差异不显著。在苗期生长时，受到干旱影响也会严重限制甘蓝型油菜的生长发育，特别是丙二醛的积累(sheikh mohammadi et al.,2017)。李阳阳等(李阳阳,李驰,任俊洋,李志,张晋峰,吕蓉蓉,张恒,吴丹,王芹,周清元,殷家明,李加纳,刘列钊,唐章林.甘蓝型油菜苗期耐旱性综合评价与耐旱性鉴定指标筛选[j].中国生态农业学报(中英文),2021,29(08):1327-1338)通过旱棚模拟干旱环境，测定了229份甘蓝型油菜苗期干旱胁迫下的生理性状，发现处理后的植株叶片的丙二醛含量及渗透物质(脯氨酸、可溶性糖)显著上升，幼苗表现出萎蔫，枯萎的情况。ayyaz等(ayyaz a.,miao y.,hannan f.,islam f.,zhang k.,xuj.,farooq m.a.,zhou w.drought tolerance inbrassica napus is accompanied with enhanced antioxidative protection,photosynthetic and hormonal regulation at seedling stage[j].physiol plant,2021,172(2):1133-1148.)使用15％peg6000处理630份油菜材料，发现在苗期生长时，植株的光合效率以及水分利用率均显著下降，叶片的过氧化物以及丙二醛含量积累明显增多，幼苗的生长明显迟缓。总的来说，不管是苗期、开花期、角果发育期，还是种子灌浆期，干旱胁迫都会导致甘蓝型油菜的产油量降低(hatzig et al.,2018,moaveni et al.,2010)。因此，对耐旱相关性状进行深度挖掘，培育耐旱甘蓝型油菜新品种在生产效益上具有首要意义。
5、我们通过深入研究bnac07.myb77基因以及其相关表达的蛋白，发现其在植物抗旱性上有负调控的作用，因此为植物干旱负调控相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是甘蓝型油菜抗旱育种提供基因与技术的支持。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种甘蓝型油菜干旱负调控基因bnac07.myb77的应用，甘蓝型油菜抗旱育种提供基因与技术的支持。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、bnac07.myb77基因在甘蓝型油菜干旱负调控上的应用，其特征在于，所述bnac07.myb77基因的核苷酸序列如seq id no.1所示或者具有如seq id no.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
4、bnac07.myb77蛋白在甘蓝型油菜干旱负调控上的应用，其特征在于，所述bnac07.myb77蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示或具有如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
5、一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法，所述方法为降低bnac07.myb77基因的表达。
6、进一步地，所述降低bnac07.myb77基因的表达的方法为通过植物病毒载体介导基因沉默，和/或，通过农杆菌介导转化干扰载体。
7、bnac07.myb77基因的克隆方法，包括以下步骤：
8、提取甘蓝型油菜叶片总rna，反转录得到第一链cdna；
9、进一步地，其中，提取甘蓝型油菜叶片总rna，反转录得到第一链cdna，包括：
10、取3颗被氯仿浸泡过的玻璃珠放入rnase-free离心管中，并将取材工具放入氯仿中浸泡一段时间，将氯仿、无水乙醇、异丙醇预冷；
11、取同处理同时期下的植物样本，装入准备好的2ml rnase-free离心管中，并迅速放入液氮中冷冻，利用打样机重复打样，确保组织粉碎彻底；
12、加入trizol试剂，利用涡旋仪充分混匀样品，放入冰上静置；
13、离心，取上清液于新的rnase-free离心管中，并加入氯仿，上下剧烈振荡，放入冰上静置；
14、静置后心，离心后吸取最上层溶液于新的rnase-free离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀多次，放入冰箱静置；
15、静置后离心，小心倒去上清，使用rnase-free水与预冷的无水乙醇配制成75％的乙醇，加入离心管中漂洗沉淀，上下颠倒多次后于冰上静置；
16、静置后离心，小心倒去部分上清，并吸干净剩余溶液，敞口静置，加入rnase-free水溶解；
17、待溶解5-10min，使用涡旋仪轻微混匀后，使用超微量分光光度计测定核酸浓度，并用1.2％凝胶电泳观察完整性后，进行反转录，得到甘蓝型油菜叶片cdna。
18、以甘蓝型油菜叶片cdna为模板，根据bnac07.myb77基因序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。
19、进一步地，其中，根据bnac07.myb77基因序列设计引物，所述引物为：
20、正向引物：5’-gactagtatggcggatcgtgtaaaaggt-3’
21、反向引物：5’-cccaagcttctactcgaccttcgtaataaa-3’。
22、上述引物中，小写英文部分表示酶切位点。
23、进一步地，所述回收和纯化pcr扩增产物，包括：
24、将含目的片段的pcr原液进行电泳，于紫外凝胶成像观测仪上切下含有目标片段大小dna的凝胶，放入离心管中称重，并计算好净重；
25、按照多倍凝胶净重体积的溶解液buffer dd，使用恒温水浴锅进行溶胶；
26、彻底溶化后，等降至室温后加入异丙醇，轻柔混匀，转移到吸附柱中，离心并弃掉废液；
27、加入洗涤液bufferw，室温离心，弃废液，后离心空甩，弃收集管；
28、将吸附柱放入新的离心管中，加入提前预热的洗脱液buffere，室温静置后离心收集dna溶液，并测定好核酸浓度后，按照实验用途保存或使用。
29、一种用于植物抗旱性能调控的基因表达系统，所述基因表达系统包含有bnac07.myb77基因以及经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有与bnac07.myb77基因相同功能的基因。
30、所述系统为表达载体，和/或，细胞系，和/或，宿主菌.
31、本发明至少具备以下有益效果：
32、本发明研究发现bnac07.myb77基因可以在甘蓝型油菜的抗旱性能上体现出来负调节的能力，即降低表达bnac07.myb77基因，可以增强植物抗旱性，因此，可以将bnac07.myb77基因应用在植物抗旱性的研究上，为植物尤其是甘蓝型油菜抗旱育种提供基因与技术的支持。
1.bnac07.myb77基因在甘蓝型油菜干旱负调控上的应用，其特征在于，所述bnac07.myb77基因的核苷酸序列如seq id no.1所示或者具有如seq id no.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的核苷酸序列。
2.bnac07.myb77蛋白在甘蓝型油菜干旱负调控上的应用，其特征在于，所述bnac07.myb77蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示或具有如seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列。
3.一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法，其特征在于，所述方法为降低bnac07.myb77基因的表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述降低bnac07.myb77基因的表达的方法为通过植物病毒载体介导基因沉默，和/或，通过农杆菌介导转化干扰载体。
5.bnac07.myb77基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其中，根据bnac07.myb77基因序列设计引物，所述引物为：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其中，提取甘蓝型油菜叶片总rna，反转录得到第一链cdna，包括：
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述回收和纯化pcr扩增产物，包括：
9.一种用于植物抗旱性能调控的基因表达系统，其特征在于，所述基因表达系统包含有bnac07.myb77基因以及经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的具有与bnac07.myb77基因相同功能的基因。
10.根据权利要求9所述的系统，所述系统为表达载体，和/或，细胞系，和/或，宿主菌。
