本发明属于生物，具体涉及一种瘤内注射的装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，及其在抗肿瘤中的应用。
背景技术：
1、近几十年来，癌症成为了世界范围内的一种高发病率和致死率的疾病，虽然根治性手术、化疗、放疗、靶向及免疫治疗等多种治疗策略在癌症中得到应用，癌症的预后得到一定提升，但仍有许多恶性肿瘤的治疗效果不佳。伴随现代分子生物学、分子免疫学等学科的飞速发展，肿瘤的生物治疗已成为继手术、放疗和化疗之后的第四大治疗模式。作为一种重要的生物治疗策略，溶瘤病毒(oncolyticvirus,ov)由于具有良好的肿瘤杀伤效果和高选择性而备受关注。溶瘤病毒(ovs)是一类前景广阔的新兴抗癌免疫疗法，它利用某些具有复制能力的病毒的先天能力感染并优先裂解肿瘤细胞，同时保护非肿瘤细胞不受损伤。溶瘤病毒能够选择性杀伤肿瘤细胞并诱导全身性抗肿瘤免疫。近年来，溶瘤病毒免疫疗法在肿瘤治疗领域蓬勃发展，不断有大量临床和基础研究。越来越多的证据表明，溶瘤病毒对肿瘤细胞的细胞毒性作用并不完全归因于直接裂解，还涉及多种途径相结合的复杂调控机制。这些机制包括调节肿瘤微环境和大环境的变化，诱导先天性免疫细胞免疫反应，以及cd8+t细胞特异性免疫反应。随着近些年来对溶瘤病毒抗肿瘤研究的深入，进一步促进了使用溶瘤病毒对肿瘤进行生物治疗的发展。目前，全世界已有多种溶瘤病毒被批准用于临床，其中较为著名的两种是我国于2005年批准的5型腺病毒(ad5)h101和美国及欧洲批准的用于瘤内和胸腹腔注射的t-vec病毒。尽管溶瘤病毒疗法在癌症治疗中有着巨大的优势，但临床治疗指南中几乎没有推荐溶瘤病毒作为恶性肿瘤的治疗方法。溶瘤病毒需要通过合适的给药方式送入肿瘤组织，并在肿瘤组织内复制进而产生抗肿瘤效果。目前，有四种溶瘤病毒产品获准用于临床，均为瘤内注射。作为已上市的溶瘤病毒药物唯一获批的给药途径，肿瘤内给药能够精确控制肿瘤微环境中的ov浓度，从而获得更好的治疗效果。然而，由于肿瘤部位存在丰富的细胞外基质(ec m)和较高的间质压力，肿瘤微环境的复杂性使瘤内注射的溶瘤病毒渗透能力严重受限，治疗效果难以保证。同时，ovs会非特异性地脱落到周围的健康组织中，从而导致不良反应；肿瘤内注射的溶瘤病毒会对癌症患者造成轻微的肝毒性。
2、肿瘤基质具有特定的生物学特性，如组织缺氧和酸中毒、间质高压形成等，在肿瘤发生、发展、转移和耐药性方面起着至关重要的作用。癌症相关成纤维细胞(cafs)是肿瘤基质不可或缺的组成部分。cafs不仅通过分泌各种细胞因子或代谢产物抑制免疫细胞的功能，促进肿瘤的发展、侵袭和转移，而且还能塑造肿瘤外基质，形成一道屏障，阻挡药物和抗肿瘤免疫细胞的渗透，降低肿瘤治疗的效果。因此，许多研究都集中于调节cafs或克服其屏障效应以抑制肿瘤。同样，肿瘤基质屏障也对溶瘤病毒的渗透和传播构成了巨大挑战。ovs必须穿过ecm才能进入并裂解肿瘤细胞，在肿瘤细胞内复制并扩散到临近肿瘤细胞。因此，有必要对cafs进行调节，以提高ov的疗效。
技术实现思路
1、针对现有技术中，由于肿瘤部位存在丰富的细胞外基质(ecm)和较高的间质压力，肿瘤微环境的复杂性使瘤内注射的溶瘤病毒渗透能力严重受限，治疗效果难以保证；同时，ov s会非特异性地脱落到周围的健康组织中，从而导致不良反应的问题。本发明提供一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备及其抗肿瘤应用，主要构建了瘤内注射的装载溶瘤病毒和抗cafs药物的注射剂，在注射后与肿瘤机体内的ca2+交联形成水凝胶，实现差速释放抗cafs药物和溶瘤病毒；该注射剂由溶瘤病毒，pt-100以及alg组成，在体外将alg、oh2和pt-100充分混合，然后瘤内注射到肿瘤部位，alg载体与肿瘤机体内的ca2+交联形成水凝胶，由此产生的水凝胶(op@alg)能够实现将oh2与抗癌相关成纤维细胞(caf)小分子药物pt-100一起封装在alg内。水凝胶负载能够使ovs在肿瘤部位保持相对较高的药物浓度，具有缓释效果，并在早期和较长时间内防止病毒向非靶组织脱落，从而避免ovs的脱靶毒性。此外，快速释放的pt-100作为一种抗cafs药物，能够使癌症相关成纤维细胞正常化，同时降低肿瘤部位的细胞外基质(ecm)含量和间质压力。随后，缓慢释放的oh2有效地感染并杀死肿瘤细胞。该水凝胶采用的梯度释放策略协同促进免疫细胞浸润和细胞毒性，导致cd8+t细胞、树突状细胞(dc)和m1型巨噬细胞在肿瘤部位的浸润增加，而m2型巨噬细胞的浸润减少。这创造了一个抗肿瘤免疫微环境，增强了溶瘤病毒的功效。该技术解决了溶瘤病毒渗透能力严重受限的问题，以及降低ovs脱落到周围的健康组织的风险，尤其适用于富含基质的肿瘤治疗。其具体技术方案如下：
2、一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，包括以下步骤：
3、s1：将海藻酸钠(alg)溶于超纯水(dd·h2o)中，制得alg溶液；
4、s2：向alg溶液中加入溶瘤病毒，并混合均匀，制得含有溶瘤病毒的alg溶液；
5、s3：将pt-100溶于超纯水中，制得pt-100溶液；
6、s4：将pt-100溶液与含有溶瘤病毒的alg溶液进行均匀混合，制得装载溶瘤病毒和pt-100的alg溶液，即装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂。
7、上述制备方法的s1中，所述alg溶液中含有海藻酸钠(alg)的浓度为5mg/ml～20mg/ml。
8、上述制备方法的s2中，所述溶瘤病毒为溶瘤单纯疱疹病毒2型(ohsv-2或oh2)。
9、上述制备方法的s2中，所述alg溶液与溶瘤病毒的混合比例为，按alg质量:溶瘤病毒滴度＝(0.5mg～2mg):106pfu进行配比。
10、上述制备方法的s3中，所述pt-100溶液中含pt-100的浓度为10mg/ml～12mg/ml。pt-100的英文名为talabostat，又称为pt100,val-boropro；供应商为talabostatmesylate,b3941,apexbio,houston,usa。
11、上述制备方法的s4中，所述pt-100溶液与含有溶瘤病毒的alg溶液的混合比例为，按溶瘤病毒滴度:pt-100质量＝106pfu:(0.005mg～0.05mg)进行配比。
12、上述制备方法制备的装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂，用于制备抗肿瘤制剂，经瘤内注射递送溶瘤病毒和pt-100达到抗肿瘤作用；其中，alg与肿瘤机体内的ca2+交联形成水凝胶，实现pt-100、溶瘤病毒的差速依次缓释。
13、本发明对装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂与生理浓度的ca2+复配交联形成水凝胶，进行如下方法的检测：
14、(1)采用扫描电子显微镜以及激光共聚焦显微镜对水凝胶进行表征，拍摄实体照片验证水凝胶在生理条件下的有效形成，在不同时间点检测水凝胶中溶瘤病毒和抗cafs药物的释放情况，验证两种药物差速释放的策略。
15、(2)体外水平通过westernblot(免疫印迹试验)验证pt-100使cafs正常化为正常的成纤维细胞，细胞杀伤实验验证装载溶瘤病毒和抗cafs药物的水凝胶对肿瘤细胞的杀伤能力来源于其中的oh2。
16、(3)通过考察皮下瘤体积，肿瘤he切片以及cafs指标的免疫荧光切片来评价水凝胶的抗肿瘤效果和体内使cafs正常化的效果。
17、(4)使用流式细胞术考察肿瘤部位的免疫细胞浸润情况验证水凝胶促进抗肿瘤免疫微环境。
18、(5)通过考察富含基质的皮下瘤体积，肿瘤he切片以及cafs指标的免疫荧光切片来评价水凝胶在富含基质的皮下瘤中的抗肿瘤效果和体内使cafs正常化的效果。
19、本发明的一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备及其抗肿瘤应用，与现有技术相比，有益效果为：
20、一、本发明的溶瘤病毒采用溶瘤hsv-2(oh2)，溶瘤hsv-2(oh2)在转移性直肠癌和食道癌患的抗肿瘤活性良好。pt-100作为成纤维细胞激活蛋白(fap)的抑制剂，通过抑制由肿瘤细胞和正常细胞分泌的刺激因子诱导成纤维细胞向癌症相关成纤维细胞的转化，同时将已经形成的癌症相关成纤维细胞正常化为正常成纤维细胞，从而减少细胞外基质(ecm)成分和免疫抑制细胞因子的分泌水平，减轻肿瘤内的免疫抑制微环境条件，同时提高免疫细胞的浸润率和免疫细胞的恢复活力水平。海藻酸钠(alg)由含有古鲁醛酸和甘露醛酸的区域组成，在体内能够快速与ca2+结合，形成“蛋盒”结构；且alg具有生物相容性和可生物降解性，alg具有柔软、无毒、高含水量和类似细胞外基质的结构等优异性能。本发明采用alg作为oh2和pt-100的载体能够实现药物在肿瘤组织内的水凝胶形成，进而实现有效控释，提高oh2的效果。
21、二、本发明利用alg载体与生理浓度的ca2+交联形成水凝胶，由此产生的水凝胶(op@alg)将oh2与抗癌相关成纤维细胞(caf)小分子药物pt-100一起封装在alg内。水凝胶负载可以使ovs在肿瘤部位保持相对较高的药物浓度，具有缓释效果，并在早期和较长时间内防止病毒向非靶组织脱落，从而避免ovs的脱靶毒性。此外，快速释放的pt-100作为一种抗cafs药物，可使癌症相关成纤维细胞正常化，同时降低肿瘤部位的细胞外基质(ecm)含量和间质压力。随后，缓慢释放的oh2有效地感染并杀死肿瘤细胞。该水凝胶采用的梯度释放策略协同促进免疫细胞浸润和细胞毒性，导致cd8+t细胞、树突状细胞(dc)和m1型巨噬细胞在肿瘤部位的浸润增加，而m2型巨噬细胞的浸润减少。这创造了一个抗肿瘤免疫微环境，增强了溶瘤病毒的功效。
22、三、我们在体外验证了差速释放水凝胶的形成，并且对差速释放水凝胶中负载的两种药物具有不同速度释放的能力。通过细胞实验验证pt-100能够使cafs正常化为正常的成纤维细胞，同时验证制剂对肿瘤细胞的杀伤能力来源于其中的oh2。接着，我们评价了制剂的抗肿瘤效果和体内使cafs正常化的效果。然后，我们使用流式细胞术考察肿瘤部位的免疫细胞浸润情况验证制剂可以促进抗肿瘤免疫微环境。最后，我们评价了制剂在富含基质的皮下瘤中的抗肿瘤效果和体内使cafs正常化的效果。我们发现装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放水凝胶有强大的肿瘤治疗效果和抗肿瘤免疫微环境的促进效果。
23、综上，溶解性单纯疱疹病毒-2(oh2)颗粒与靶向cafs的小分子药物pt-100一起被载入海藻酸钠(alg)中。pt-100的快速释放起到了抗cafs的作用，减少了细胞外基质(ecm)，减轻了肿瘤部位的间隙压力。因此，延迟释放的oh2可以更有效地侵袭和消灭肿瘤细胞，同时还能促进免疫细胞向肿瘤微环境的渗透，从而建立一个对肿瘤有利的免疫环境。这种方法在实现高效、低毒性的溶瘤病毒疗法方面具有巨大潜力，该技术解决了溶瘤病毒渗透能力严重受限的问题，以及降低ovs脱落到周围的健康组织的风险，尤其适用于富含基质的肿瘤治疗。
1.一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，其特征在于，s1中，所述alg溶液中含有海藻酸钠的浓度为5mg/ml～20mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，其特征在于，s2中，所述溶瘤病毒为溶瘤单纯疱疹病毒2型。
4.根据权利要求1所述的一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，其特征在于，s2中，所述alg溶液与溶瘤病毒的混合比例为，按alg质量:溶瘤病毒滴度＝(0.5mg～2mg):106pfu进行配比。
5.根据权利要求1所述的一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，其特征在于，s3中，所述pt-100溶液中含pt-100的浓度为10mg/ml～12mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，其特征在于，s4中，所述pt-100溶液与含有溶瘤病毒的alg溶液的混合比例为，按溶瘤病毒滴度:pt-100质量＝106pfu:(0.005mg～0.05mg)进行配比。
7.一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的应用，采用权利要求1所述的一种装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂的制备方法，制备得到的装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂，其特征在于，装载溶瘤病毒和抗cafs药物的差速释放注射剂用于制备抗肿瘤制剂，经瘤内注射递送溶瘤病毒和pt-100达到抗肿瘤作用；其中，al g与肿瘤机体内的ca2+交联形成水凝胶，实现pt-100、溶瘤病毒的差速依次缓释。
