本发明属于生物检测领域，具体涉及一种油溶性改性的花菁染料、制备方法及其应用。
背景技术：
1、多重流式荧光技术是以多重荧光编码微球为固相载体，在微球上进行蛋白/核酸的偶联，然后与待测物进行反应，之后依靠鞘流的原理，以单个微球形式依次通过检测器，对待测物进行定量分析。多重流式荧光检测技术是一种高度灵敏且多参数的分析方法，其结合了流式细胞术(flow cytometry)和荧光检测技术的优势，能够同时检测和分析多个生物分子或细胞表面标志物，在免疫学、细胞生物学、分子诊断等领域有着广泛的应用。
2、荧光编码微球(fluorescent encoded microspheres)在多重流式荧光检测技术中扮演着至关重要的角色，其主要作用包括：(1)信号载体，微球表面可以固定不同的荧光标记，作为信号的载体，每个微球代表一个特定的检测目标；(2)多重检测，通过使用具有不同荧光编码的微球，可以实现对多个不同生物分子的同时检测；(3)细胞分选，在某些应用中，微球还可以用于细胞分选，通过荧光信号区分不同的细胞群体。
3、作为荧光编码微球的荧光指示信号，荧光染料也起到关键的作用，由于荧光染料的种类较多，可以根据所需编码的维度和检测的灵敏度要求选择合适的荧光染料。花菁染料，是一种发色团共轭体子两端建立在n-n原子间的脒离子插烯物的多甲川染料的衍生物，属有机染料，当两个氮原子及部分多甲川链为杂环核的组成部分时，即形成典型的花菁染料；按分子结构类型，分直链类、桥链类、环丁烯二酮类、克酮类等。花菁染料因其特别的共轭骨架结构、结构的可设计性、高的吸收系数、高荧光量子产率、良好的化学稳定性和可调的光谱特性，是荧光编码微球中常用的荧光染料之一。通过使用不同种类的花菁染料或改变单一染料的浓度，可以生成具有不同荧光特性的编码微球，从而实现多重检测和分析。此外，花菁染料的荧光信号可以在红外或近红外区域，这对于减少生物样本中背景信号的干扰具有重要的作用。
4、常用花菁染料例如cy3、cy5、cy7等，均带有i-/br-/cl-等卤素阴离子，卤素阴离子的存在导致染料亲油性差，不易进入油相聚合物微球内部，降低其在二氯甲烷、甲苯等有机溶剂中的溶解度，从而影响染色的均匀性及微球的稳定性，最关键的影响则是限制了在单个微球中使用的染料量，进而限制可实现的编码范围和检测重数，难以实现多重检测的需求。
5、因此，急需开发一种对花菁染料进行改性的方法及产品，从而提高花菁染料编码的微球种类以及检测重数，提高花菁染料的使用性能和应用价值。
技术实现思路
1、基于此，本申请的目的在于提供一种快速简单的花菁染料亲油性改性方法以及使用该方法改性的花菁染料产品。该方法将花菁染料分子中的卤素阴离子替换为亲油性强电负性有机阴离子，从而大大改善染料的亲油性，使得花菁染料更容易进入聚合物微球内部，进而使其在油相中的溶解度提高数十甚至数百倍，能够达到常用平衡溶胀法、包埋法等微球染色的需求，实现微球染色。
2、为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了有机阴离子作为油溶性改性剂在制备油溶性改性的花菁染料中的用途。
4、进一步的，所述有机阴离子的结构通式如以下式(ⅰ)所示：
5、
6、其中，r1-r4各自独立地为c1-c4烷基、c6-c24芳基、或4-7元杂环基，其中杂环基中的杂原子为n、s、o、p；
7、b为硼。
8、第二方面，本发明提供了一种油溶性改性的花菁染料，其结构通式如以下式(ⅱ)所示：
9、
10、其中，r1-r6为取代基；
11、r-为权利要求2所述的有机阴离子；
12、进一步地，式(ⅱ)中的两个苯环替代为萘基。
13、第三方面，本发明还提供了一种油溶性改性的花菁染料的制备方法，包括以下步骤：
14、(1)使用有机溶剂分散花菁染料，所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、石油醚的一种或多种；
15、(2)向步骤(1)的花菁染料溶液中加入有机阴离子盐进行反应；
16、(3)去除步骤(2)制得的反应产物中的有机溶剂；
17、(4)使用展开剂，通过凝胶色谱柱分离步骤(3)的反应产物中的油溶性改性的花菁染料；
18、优选地，所述展开剂为体积比(1-30):(70-99)的甲醇和二氯己烷；
19、(5)去除展开剂，得到高纯度的油溶性改性的花菁染料结晶。
20、进一步的，所述的油溶性改性的花菁染料的制备方法中，所述步骤(2)中的反应温度为2-35℃，反应时间为5-10min。
21、第四方面，本发明还提供了一种多色荧光编码微球，包括乳胶种子和包覆在乳胶种子内部的荧光染料，所述的荧光染料为以上所述的油溶性改性的花菁染料或采用以上所述的制备方法制得的油溶性改性的花菁染料。
22、第五方面，本发明还提供了一种所述的多色荧光编码微球的制备方法，包括以下步骤：
23、(1)称取乳胶种子分散于纯水中制得种子分散液；
24、(2)称取油溶性改性的花菁染料溶于有机溶剂中，所述有机溶剂包括二氯甲烷、四氢呋喃或甲苯的一种或多种；
25、(3)向步骤(2)的染料溶液中加入油水共溶剂，所述油水共溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇、正丁醇的一种或多种组合；
26、(4)将步骤(3)的染料溶液与步骤(1)的种子分散液混合溶胀，以达到溶胀平衡为准；
27、优选地，混合溶胀时间为20min-1h；
28、(5)去除有机溶剂并清洗得到多色荧光编码微球。
29、进一步的，所述的多色荧光编码微球的制备方法中，乳胶种子的粒径为100nm～25μm，所述乳胶种子和油溶性改性的花菁染料的质量比为0.00001％～20％。
30、第六方面，本发明还公开了以上所述的多色荧光编码微球或采用以上所述的制备方法制得的多色荧光编码微球在制备多重检测试剂中的应用。
31、第七方面，本发明还公开了一种诊断试剂盒，包括以上所述的多色荧光编码微球或采用以上所述的制备方法制得的多色荧光编码微球。
32、相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
33、本发明提供了一种油溶性改性的花菁染料、制备方法及其应用，使用有机阴离子对花菁染料中的卤素阴离子进行替代，极大改善了花菁染料的亲油性，花菁染料亲油性的改善有利于其在制备荧光微球的过程中进入微球内部，提高其在油相中的溶解度，进一步提高了荧光微球的荧光性能和应用价值。
1.有机阴离子作为油溶性改性剂在制备油溶性改性的花菁染料中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述有机阴离子的结构通式如以下式(ⅰ)所示：
3.一种权利要求1或2中所述的油溶性改性的花菁染料，其特征在于，所述花菁染料的卤素阴离子被一种或多种有机阴离子替代，其结构通式如以下式(ⅱ)所示：
4.一种权利要求3所述的油溶性改性的花菁染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的油溶性改性的花菁染料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的反应温度为2-35℃，反应时间为5-10min。
6.一种多色荧光编码微球，其特征在于，包括乳胶种子和包覆在乳胶种子内部的荧光染料，所述的荧光染料为权利要求3所述的油溶性改性的花菁染料或采用权利要求4或5所述的制备方法制得的油溶性改性的花菁染料。
7.权利要求6所述的多色荧光编码微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的多色荧光编码微球的制备方法，其特征在于，乳胶种子的粒径为100nm-25μm，所述乳胶种子和油溶性改性的花菁染料的质量比为0.00001-20％。
9.权利要求6所述的多色荧光编码微球或采用权利要求7或8所述的制备方法制得的多色荧光编码微球在制备多重检测试剂中的应用。
10.一种诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的多色荧光编码微球或采用权利要求7或8所述的制备方法制得的多色荧光编码微球。
