本发明属于生物检测，尤其涉及cob np纳米酶的制备方法及基于cob np纳米酶的检测试剂盒及其检测系统。
背景技术：
1、非小细胞肺癌(nsclc)是全球癌症导致死亡的主要原因之一。许多报告显示，因为表皮生长因子受体(egfr)基因改变的nsclc患者可以接受靶向治疗，其中，对egfr基因的检测可以为nsclc患者提供个性化的治疗方案和更好的预后。由于循环肿瘤dna(ctdna)是肿瘤衍生的碎片化基因，存在于癌症患者的血液中，因此从患者外周血中开展液体活检ctdna成为一种新的有前景的非侵入性癌症诊断和治疗手段。尽管有许多基于聚合酶链反应(pcr)的方法，或基于荧光、电化学、化学发光等技术的生物传感器已被应用于检测ctdna，但一些缺点，包括价格昂贵、需要先进的仪器等，限制了它们的广泛使用。
2、纳米酶，作为一种模拟天然酶活性的纳米材料，因其独特的物理化学性质及稳定性，在生物传感、环境监测、医疗诊断等领域展现出巨大潜力。比色传感系统，作为一种简单、直观、无需复杂仪器的检测方法，通过与纳米酶的结合，极大地拓宽了其应用范围。具体而言，纳米酶比色传感系统能够通过催化特定底物产生颜色变化，实现对目标物的定性和定量检测。纳米酶比色传感系统已被广泛应用于生物标志物、病原体、毒素等的检测。例如，基于铂纳米颗粒的比色传感器可以灵敏地检测血液中葡萄糖含量；金纳米颗粒则被广泛用于检测蛋白质、dna等生物分子。然而，现有纳米酶比色传感系统在实际应用中仍面临一些挑战，如检测灵敏度、选择性、稳定性及便携性等方面仍有待提升。此外，对于复杂生物样品中的低丰度目标物检测，尤其是循环肿瘤dna(ctdna)的检测，传统方法存在操作复杂、耗时较长、设备要求高等问题。
3、硼化钴纳米材料在某些化学反应中表现出优异的催化活性，可以替代或部分替代传统的贵金属催化剂，降低成本。硼化钴具有良好的导电性，这对于电化学应用(如电池、超级电容器等)尤为重要。相对于某些贵金属催化剂，硼化钴纳米材料在恶劣环境下的稳定性更好，更适合用于工业生产过程。通过控制合成条件，可以调控硼化钴纳米材料的形貌、尺寸和表面性质，从而优化其催化性能。但是硼化钴纳米材料也面临诸多劣势及挑战，虽然硼化钴纳米材料在催化领域展现出巨大潜力，但其生物相容性尚未得到充分研究，这限制了其在生物医药领域的应用。目前关于硼化钴纳米材料的毒性研究相对较少。虽然相对于贵金属催化剂而言，硼化钴纳米材料的成本较低，但其合成过程可能仍需要较高的能量和原料投入。硼化钴纳米材料在实际应用中的环境稳定性(如耐腐蚀性、抗老化性等)需要进一步验证和优化。
4、硼化钴纳米材料在催化等领域展现出巨大潜力，但其在实际应用中仍面临诸多挑战。未来需要进一步的研究和开发来解决这些问题，以实现硼化钴纳米材料的广泛应用。
5、在poct检测方法中，基于纳米酶的比色传感系统展现出独特优势。通过设计特异性识别ctdna的纳米酶探针，结合便携式比色检测设备，可以实现对ctdna的快速、灵敏检测。然而，现有技术中仍存在一些缺陷，如特异性不足、灵敏度有待提升、操作便捷性不够等问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供cob np纳米酶的制备方法，
2、cob np纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
3、s1：在装有乙二醇的聚四氟乙烯反应器中，加入聚乙烯吡咯烷酮和原料硼化钴粉末，各原料配比按照如下：乙二醇：聚乙烯吡咯烷酮：硼化钴粉末体积质量比为4：45：15(ml:mg:mg)，混匀备用；
4、s2：在s1的反应器中再加入h2o2和冰醋酸混合物，h2o2:冰醋酸的体积比为1:100(ml:ul)，封闭所述反应器，放入烘箱中，在160℃下进行反应120分钟；
5、s3：离心12000rpm 20分钟收集沉淀物，并分别用无水乙醇和去离子水离心洗涤3次；
6、s4：收集的沉淀物重新溶解在去离子水中，并使用超声处理器处理，5000rpm离心1分钟，收集上清液，上清液以12000rpm离心10分钟后，收集的沉淀物为cob np纳米酶。
7、本发明的目的之二在于提供cob np纳米酶的试剂盒；
8、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9、基于cob np纳米酶的生物检测试剂盒，包括生物芯片，检测试剂，所述检测试剂包含所述cob np纳米酶制备的sp-cob np纳米酶信号探针，所述sp-cob np纳米酶信号探针(sp)dna序列为seq id no：3所示，信号探针(sp)5′端修饰氨基，所述生物芯片上链接有捕获探针，所述捕获探针dna(cp)的dna序列为：seq id no：1所示，捕获探针(cp)3′端修饰氨基。
10、进一步，所述生物芯片有三层结构，顶部为分裂层，包含通道和加样区；底部为收集层，用于收集反应废液；中间为检测层，所述检测层上的反应区域分别通过氨基共价连接捕获探针dna(cp)；
11、进一步，所述sp-cob np纳米酶信号探针的制备方法包括以下步骤：
12、s1：将浓度为5μm氨基修饰的信号探针(sp)与浓度为1mg/ml cob np纳米酶1:1体积比混合于0.01m磷酸盐缓冲溶液中，
13、s2：在4℃下反应约12h，所述反应中信号探针(sp)上的氨基与cob np纳米酶表面的羟基共价连接，
14、s3：将s2步骤的产物离心收集的沉积物为sp-cob np纳米酶信号探针，将所述sp-cob np纳米酶信号探针重新溶解于0.01m磷酸盐缓冲溶液中备用。
15、进一步，所述生物芯片的制备方法包括以下步骤：
16、s1：将2.5μl壳聚糖(0.25mg/ml)分别滴在纸基芯片检测层的反应区上；
17、s2:将s1步骤处理后的检测层室温干燥后再滴上2.5μl戊二醛(2.5％，v/v)，戊二醛的醛基与壳聚糖的氨基共价连接
18、s3:s2步骤处理完成后反应2小时，再滴2.5μl，5μm氨基修饰的捕获探针(cp)，共价连接半小时后滴加1％ bsa封闭未反应位点半小时，即可制得所述生物芯片。
19、进一步，所述生物芯片上的反应区有两个，一个为比色法反应区，另一个为气压法反应区，每个反应区连接捕获dna。
20、进一步，所述生物芯片为双模弹出式纸质芯片，且所述生物芯片可特异性结合肺癌靶标ctdna。
21、本发明的目的之三是基于cob np纳米酶生物检测试剂盒的检测系统，包含上述生物检测试剂盒，还包含具有智能比色处理终端和便携式气压计，所述智能比色处理终端可以是移动终端；
22、利用上述检测系统检测目标靶标的步骤如下：
23、s1：将靶标和sp-cob np的混合物滴在所述构建芯片的分裂区的加样层上孵育，并洗涤；
24、s2：将检测层中的两个反应区域分别剪下，对于比色模式，将含有tmb和h2o2混合物的乙酸钠缓冲液滴入芯片，然后放入3d打印的暗盒中，然后使用智能手机在3分钟后拍照并通过设计比色应用程序的移动终端进行检测，对于压力模式，将剪下的纸放入含有h2o2(30％，wt％)的ep管中并立即盖上盖子密封，然后插入盐水输液针并连接到便携式气压计进行检测，并在6分钟后记录压力。
25、进一步，所检测的靶标为肺癌ctdna。
26、与现有技术发明，本发明具如下有益效果：
27、本发明提供了一种简便、快速且成本效益高的ctdna检测方法，特别适用于肺癌ctdna的检测；
28、集成比色法和气压法两种检测模式，提高了检测的灵敏度和特异性；
29、弹出式纸芯片设计使得操作更加便捷，适用于现场检测和即时诊断。
30、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
1.cob np纳米酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.基于cob np纳米酶的生物检测试剂盒，包括生物芯片，检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包含权利要求1所述的cob np纳米酶制备的sp-cob np纳米酶信号探针，信号探针(sp)5′端修饰氨基，所述生物芯片上链接有捕获探针(cp)，捕获探针3′端修饰氨基。
3.根据权利要求2所述的cob np纳米酶的生物检测试剂盒，其特征在于：所述sp-cobnp纳米酶信号探针(sp)的dna序列为seq id no：3所示，所述捕获探针(cp)的dna序列为：seq id no：1所示，可特异性结合肺癌靶标ctdna。
4.根据权利要求2或3所述的基于cob np纳米酶的生物检测试剂盒，其特征在于：所述生物芯片有三层结构，顶部为分裂层，包含通道和加样区；底部为收集层，用于收集反应废液；中间为检测层，所述检测层上反应区域通过氨基共价连接权利要求2所述的捕获探针(cp)。
5.根据权利要求4所述基于cob np纳米酶的生物检测试剂盒，其特征在于：所述生物芯片为双模弹出式纸质芯片。
6.根据权利要求3所述的基于cob np纳米酶的生物检测试剂盒，其特征在于：所述sp-cob np纳米酶信号探针的制备方法如下：
7.根据权利要求5所述的基于cob np纳米酶的生物检测试剂盒，其特征在于：所述生物芯片的制备方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述cob np纳米酶的生物检测试剂盒，其特征在于：所述生物芯片上的反应区有两个，一个为比色法反应区，另一个为气压法反应区，每个反应区上连接捕获探针(cp)。
9.根据权利要求5-8任一所述cob np纳米酶的生物检测试剂盒的检测系统，其特征在于：包含所述的生物检测试剂盒，还包含具有智能比色处理终端和便携式气压计，所述智能比色处理终端可以是移动终端。
10.根据权利要求9所述检测系统，其特征在于：检测目标靶标的步骤如下：
