本发明属于生物学，尤其涉及一种牙髓干细胞外泌体在制备骨损伤修复制剂中的应用。
背景技术：
1、人体骨骼结构致密、解剖复杂、生长缓慢，其损伤修复一直是临床治疗的难点。目前临床用于骨损伤修复的植入性医疗器械以提取的天然小牛胫骨制品为主，此类产品存在修复活性低、人体相容性差、过敏反应多发等缺点。还有人工合成的类骨质基材同样存在诸多问题，治疗效果并不十分令人满意。
2、大块骨缺损的愈合机制受到多种诱导因子的调控，包括前期成骨细胞的活性调节和后期骨形成调控。干细胞由于其特有的自我更新和多向分化能力成为医学领域的重要突破点，多能干细胞、牙髓间充质干细胞，在骨损伤修复中都能发挥促进作用。目前对于干细胞直接治疗的审批仍然在一定程度上处于谨慎的状态，多能干细胞的诞生突破了胚胎干细胞研究时期进行临床转化的重要伦理障碍。其安全性也在获得了一定的认可，但是目前阶段对于干细胞治疗仍然具有高成本的问题，体现在包括干细胞储存运输的成本以及过程中的风险。干细胞治疗过程所可能产生的诱导成瘤等风险也需要进一步研究和优化。
3、近年来随着外泌体研究的进展，极大提升了干细胞使用的安全性并拓宽了干细胞的应用渠道。外泌体是细胞外脂质纳米囊泡，大小约为30~150nm，在大多数活细胞中通过胞吐作用主动分泌，存在于所有体液中，如血浆、尿液、血清、唾液和脑脊液等。外泌体含有脂质双分子膜结构，携带典型的跨膜蛋白和受体、粘附分子、脂筏相关蛋白、免疫调节分子。在外泌体腔内，可以发现多种蛋白质和核酸，根据不同的细胞类型而不同。作为细胞间通讯的关键信使，外泌体将生物活性分子传递给受体细胞，从而参与多种病理生理过程，包括肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等。
4、有研究报道也指出，在干细胞发挥的分泌功能中，外泌体是旁分泌作用中发挥主要作用的部分之一。外泌体具有纳米级的双层膜结构，包含在细胞间通讯中起关键作用的脂质、微小rna和蛋白质，由于其具有较低的免疫原性和致瘤性，以及易于储存管理的特性，外泌体已经成为一种全细胞疗法的替代品。牙髓干细胞外泌体有希望在骨损伤修复领域发挥有效作用，但是常规培养干细胞外泌体的分泌量较低、骨损伤修复活性偏低等问题仍有待解决。因此，如何提高牙髓干细胞分泌量和诱导牙髓干细胞产生针对骨损伤修复的外泌体是牙髓干细胞外泌体在骨裂损伤修复制剂中应用的关键。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种牙髓干细胞外泌体在制备骨损伤修复制剂中的应用，从而利用牙髓干细胞外泌体更好的实现骨损伤修复效果。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
3、首先，本发明提供了一种牙髓干细胞外泌体在制备骨损伤修复制剂中的应用，所述骨裂损伤修复制剂为牙髓干细胞在金黄色葡萄球菌裂解物刺激下产生的外泌体。
4、进一步地，所述干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：
5、（1）分离培养牙髓干细胞；
6、（2）制备金黄色葡萄球菌裂解物；
7、（3）牙髓干细胞传代到细胞培养瓶中，传代次数不超过5代，细胞传代密度为1×106/ml，二氧化碳培养箱内培养24h，待细胞密度达到80%以上；
8、（4）细胞瓶中加入金黄色葡萄球菌裂解物，继续培养24h，收集细胞培养上清，加入1/100体积的金黄色葡萄球菌裂解物兔多克隆抗体，置于37℃恒温培养箱中孵育1小时，12000rpm离心10min，收集上清液。
9、（5）将外泌体提取试剂和细胞培养上清液按照1∶1的比例混合，静置16小时后，12000rpm离心1小时收集沉淀物，用原培养液1/10体积pbs溶解外泌体。
10、进一步地，所述金黄色葡萄球菌裂解物在牙髓干细胞培养基中的添加剂量为40μg/ml。
11、进一步地，所述金黄色葡萄球菌裂解物的制备方法包括如下步骤：
12、（1）取实验室冻存的金黄色葡萄球菌（atcc 25923），用接种环在lb琼脂平板上划线，37℃培养24小时。
13、（2）挑取边缘整体的圆形菌落接种lb液体培养基，37℃摇床中220rpm/min震荡培养24小时。
14、（3）12000rpm/min离心5分钟，弃去1/2的上清液，用原体积1/2的上清液重悬菌体沉淀。
15、（4）重悬的菌液超声波破碎仪破碎，12000rpm/min离心5分钟，收集上清液。
16、（5）破碎的菌液用0.22μm的滤器过滤即为金黄色葡萄球菌裂解物，测定蛋白浓度，4℃保存备用。
17、其次，本发明提供了一种用于提高牙髓干细胞外泌体产量的生物制剂，所述生物制剂为金黄色葡萄球菌裂解物。
18、进一步地，所述生物制剂在牙髓干细胞培养基中的添加剂量为40μg/ml。
19、进一步地，所述生物制剂的制备方法包括如下步骤：
20、（1）取实验室冻存的金黄色葡萄球菌（atcc 25923），用接种环在lb琼脂平板上划线，37℃培养24小时。
21、（2）挑取边缘整体的圆形菌落接种lb液体培养基，37℃摇床中220rpm/min震荡培养24小时。
22、（3）12000rpm/min离心5分钟，弃去1/2的上清液，用原体积1/2的上清液重悬菌体沉淀。
23、（4）重悬的菌液超声波破碎仪破碎，12000rpm/min离心5分钟，收集上清液。
24、（5）破碎的菌液用0.22μm的滤器过滤即为金黄色葡萄球菌裂解物，测定蛋白浓度，4℃保存备用。
25、本发明的有益效果在于：
26、本发明通过培养金黄色葡萄球菌，制备金黄色葡萄球菌裂解物，用金黄色葡萄球菌裂解物刺激牙髓干细胞制备外泌体，再用黄色葡萄球菌裂解物兔多抗中和黄色葡萄球菌裂解物中的毒力因子，纯化得到外泌体。与常规培养的牙髓干细胞外泌体相比，使用金黄色葡萄球菌裂解物刺激可以显著提高牙髓干细胞外泌体的分泌量。将外泌体用于小鼠骨损伤修复时，相同剂量的外泌体作用颅骨缺损修复，术后3周，金黄色葡萄球菌裂解物培养外泌体组小鼠颅骨缺损相对面积是常规外泌体组的83.92%，是模型组的56.77%，金黄色葡萄球菌裂解物培养外泌体的骨损伤修复效果显著优于常规外泌体组。
1.一种牙髓干细胞外泌体在制备骨损伤修复制剂中的应用，其特征在于，所述骨裂损伤修复制剂为牙髓干细胞在金黄色葡萄球菌裂解物刺激下产生的外泌体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌裂解物，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌裂解物在牙髓干细胞培养基中的添加剂量为40μg/ml。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌裂解物，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌裂解物的制备方法包括如下步骤：
5.一种用于提高牙髓干细胞外泌体产量的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为金黄色葡萄球菌裂解物。
6.根据权利要求5所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂在牙髓干细胞培养基中的添加剂量为40μg/ml。
7.根据权利要求6所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的制备方法包括如下步骤：
