本发明涉及生物，具体是一种桑树原生质体分离及融合的新方法。
背景技术：
1、近年来,植物原生质体的研究越来越受到重视,研究重点已从原生质体的分离、原生质体的生理生化特性和原生质体再生植株的获得,转移到原生质体的应用等方面。
2、长期以来,桑树作为重要的经济树种,是"桑-蚕-丝"产业的重要物质基础。目前,已经利用不同的桑树外植体建立了多种离体培养体系。每个细胞的原生质体都含有该个体的全部遗传信息,在适当的培养条件下具有再生成与其亲本相似个体的全能性,在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的。但建立并筛选出具有合适形状和基因的原生质体仍是一大难题。
3、近十多年来,在生物科学方面,逐渐建立起植物原生质体培养的新技术,它是生物科学新成就之一。植物原生质体可以再生植株,可以吸收外源遗传物质,异源原生质体可融合并长成杂种植株,它将成为育种的新途径。原生质体也是细胞生物学、植物生理学、遗传学、病毒学和分子生物学基础研究的很好的实验材料,因而开展原生质体的研究,将有广阔的前景。对提取桑叶原生质体的酶解时间、纤维素酶的用量进行了初步研究，但由于原生质体有多种形态，难以筛选出具有合适性状的原生质体，再加上目前的酶解液配比溶壁性差，溶解效率低，且在酶解过程中，难以得到大量的原生质体来进一步育种，这对探究利用精确地酶解液配比具有重要的理论和育种实践意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供桑树组织培养体系的建立为桑树的快速繁育及品种改良的一条高效途径，提高它原生质体的生命力。主要从幼嫩茎叶的分生组织，外植体培养，愈伤组织的培养及原生质体的培养等方面综述了桑树组织培养的研究进展,主要讨论了外植体和培养基的选择,不同比例的亲本混合及其酶的比例对原生质体的制备和融合的影响。
2、本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
3、该水解技术的使用方法如下步骤：
4、本研究构建了特异性引物通过pcr扩增筛选分子标记，利用分子标记筛选出具有目标性状的夏津鲁桑1号和台湾长果桑幼嫩的茎叶的分生组织来培育外植体,以ms、b_5、n_6、wpm为基本培养基,附加不同浓度的细胞分裂素(6-ba)、激动素(kt)和生长素(2,4-d)和萘乙酸(naa)等,培养基中添加蔗糖3％,琼脂0.8％,ph值为5.8,以完成桑树无菌体系的建立,来培养愈伤组织。
5、将得到的愈伤组织加入到2％复合纤维素酶、0.5％半纤维素酶和0.5％果胶酶4:3:4核心配比的培养基中进行培养以获得游离的原生质体和原生质球。使水解细胞壁的效率由原来的15％达到了70％以上。将得到的原生质体染色后镜检，若处理干净则无荧光，反之有荧光。为检验原生质体的生命活力，取一滴放在蒸馏水中镜下观察是否破裂不破裂，然后取一滴放在光合作用呼吸作用仪器中检测仪器的指标。结果表明:在2％复合纤维素酶、0.5％半纤维素酶和0.5％果胶酶4:3:4核心配比的培养基中培养得到的原生质体细胞壁溶解的最好且原生质体生命活力最好达到90％以上。为分离纯化得到的原生质体，除去细胞壁残留的和细胞破裂的原生质体，采用低速离心法进行清洗，时间控制在5min内，清洗2-3次，转速为4000rpm。
6、原生质体的融合方法：该融合方法包括：将夏津鲁桑1号和台湾长果桑原生质体1:1混合，通过低速离心的方法，拉近原生质体间的距离，使原生质体细胞膜接触面积大，促进原生质体的融合，将离心过后的原生质体滴在分子量为4000-6000的聚乙二醇溶液中进行融合，同时加入浓度为100毫摩尔每升的二价金属离子(氯化锰，氯化钙)来屏蔽细胞表面的负电荷静电作用来促进融合，减少细胞的凝集从而提高了融合效率。使原生质体的活力达到90％以上。在加入二甲金属离子之后5min内用原生质体营养液(一定的水分，氨基酸，维生素，无机盐，生长因子)快速洗涤使之迅速脱离有毒环境，加入营养液后以转速4000rpm低速离心2-3min，再放入再生培养基中3-5天使其长出细胞壁。
7、创新应用综合技术：
8、精准鉴定杂合细胞特异性染料精确形成色相筛选出适合的杂种细胞构建5种特异性cdna分子标记结合从美洲商陆中提取的特异性染料精确鉴定杂种细胞，以获得具有优良形状的杂种细胞，为植株的培育做好前期的准备。
9、对比现有技术，本发明的有益效果在于：
10、1、不会破坏细胞自身结构。
11、2、核心配比，使得酶解速度加快，提高了原生质体的制备效率。
12、3、由于制备速度的加快，减少了逆反应的发生。
1.一种桑树原生质体分离及融合的新方法，其特征在于：包括以下技术：
2.根据权利要求1所述一种桑树原生质体分离及融合的新方法，其特征在于：高效细胞壁水解技术：
3.根据权利要求2所述一种桑树原生质体分离及融合的新方法，其特征在于：在2％复合纤维素酶、0.5％半纤维素酶和0.5％果胶酶4:3:4核心配比的培养基中培养得到的原生质体细胞壁溶解的最好且原生质体生命活力最好达到90％以上；为分离纯化得到的原生质体，除去细胞壁残留的和细胞破裂的原生质体，采用低速离心法进行清洗，时间控制在5min内，清洗2-3次，转速为4000rpm。
4.根据权利要求1所述一种桑树原生质体分离及融合的新方法，其特征在于：原生质体的融合方法：
5.根据权利要求1所述一种桑树原生质体分离及融合的新方法，其特征在于：创新应用综合技术：
