本发明属于细胞培养，具体涉及一种卵巢卵黄囊瘤来源的循环肿瘤细胞的分离与培养方法。
背景技术：
1、恶性肿瘤是人类健康的主要威胁之一。绝大多数肿瘤相关的死亡是由肿瘤的复发和转移导致的。然而肿瘤转移的机制尚不完全清楚。揭示肿瘤复发和转移的机制，对开发新的诊断和治疗方法至关重要。实体肿瘤会持续脱落肿瘤细胞，部分脱落的细胞能进入血液循环系统，被称为循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞是恶性肿瘤经血液转移的关键媒介。如果能确定循环肿瘤细胞的特异性标记和生物学特性，则有望建立新的肿瘤转移风险诊断方法，甚至开发特异性药物降低肿瘤转移的发生几率。
2、由于循环肿瘤细胞数量非常少。绝大多数肿瘤患者每10ml外周血中的循环肿瘤细胞数量少于10个。而同样体积的外周血却包含了数千万的血液细胞，给循环肿瘤细胞的提取和研究带来了较大的困难。由于循环肿瘤细胞与其原位的实体瘤细胞功能和表型不尽相同。循环肿瘤细胞发生了包括上皮-间质转变在内的一系列变化，使其能适应无锚定生长和血液流动形成的剪切力。不仅如此，研究表明循环肿瘤细胞的表型存在异质性和动态变化。这给研究循环肿瘤细胞带来了更大的困难。
3、作为恶性肿瘤的一个示例，生殖细胞肿瘤(germ cell tumor,gct)起源于原始生殖细胞，主要包括卵黄囊瘤(yolk sac tumor,yst)、无性细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、多胚癌和非妊娠绒毛膜癌，临床上常见两种及两种以上组织学亚型组成的混合型。其发病年龄早，常见于性腺(卵巢或睾丸)，也可见于阴道、纵隔、腹膜后和颅脑等。gct对化疗敏感，自以顺铂为基础的化疗应用以来，患者预后明显改善。大多数患者即使发病时已出现远处转移，经正规治疗后仍可得以长期生存。但约10％～20％患者出现复发，往往伴随化疗耐药，治疗效果不佳，临床处理十分棘手，而复发的gct常为卵黄囊瘤或含卵黄囊瘤成分。
4、如果能通过提取循环肿瘤细胞进行体外培养的方式建立循环肿瘤细胞系，将对推动肿瘤转移和治疗的研究起到巨大的帮助。
技术实现思路
1、为了解决上述至少一个问题，本公开提供了一种循环肿瘤细胞的富集和培养方法及其应用。
2、根据本公开的一个方面，提供了一种循环肿瘤细胞的富集和培养方法，所述方法包括如下步骤：
3、1)采集样本；
4、2)从所述样本富集循环肿瘤细胞；
5、3)使用第一培养基，重悬所富集到的循环肿瘤细胞并进行培养，获得第一培养产物，其中所述第一培养基包括基础培养基和5％～20％的血清；和
6、4)使用第二培养基替换第一培养基进行维持培养，获得第二培养产物，其中所述第二培养基包括基础培养基和5％～20％的血清替代物。
7、在一些实施方式中，所述样本来自患有或者曾经患有实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤的受试者。
8、在一些实施方式中，所述样本包括体液或其衍生物。在一些实施方式中，所述样本可以选自血液、血浆、血清、淋巴、唾液、尿液、汗液或腹水。在一些实施方式中，所述样本可以是腹水。
9、在一些实施方式中，所述循环肿瘤细胞(ctc)是转移性ctc。
10、在一些实施方式中，所述ctc可以包括，但不限于，急性白血病细胞、急性t细胞白血病细胞、急性淋巴细胞性白血病细胞、急性髓细胞性白血病细胞、成髓细胞性白血病细胞、前髓细胞性白血病细胞、髓单核细胞白血病细胞、单核细胞白血病细胞、红白血病细胞、慢性白血病细胞、慢性髓细胞性(粒细胞)白血病细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、真性红细胞增多症细胞、淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症细胞(macroglobulinemia cell)、重链病细胞、肉瘤细胞、纤维肉瘤细胞、粘液肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、软骨肉瘤细胞、成骨性肉瘤细胞、淋巴管肉瘤细胞、间皮瘤细胞、尤因瘤细胞(ewing'stumor cell)、平滑肌肉瘤细胞、横纹肌肉瘤细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、卵巢卵黄囊瘤细胞、前列腺癌细胞、去势抗性前列腺癌细胞(castration resistantprostate cancer cell)、鳞状细胞癌细胞、基底细胞癌细胞、腺癌细胞、汗腺癌细胞、皮脂腺癌细胞、乳头状癌细胞、乳突状腺癌细胞、囊腺癌细胞、髓样癌细胞、支气管原性细胞、肾细胞癌细胞、肝细胞瘤细胞、胆管癌细胞、绒毛膜癌细胞、精原细胞瘤细胞、胚胎性癌细胞、维尔姆斯瘤细胞(wilms'tumor cell)、宫颈癌细胞、子宫癌细胞、睾丸肿瘤细胞、肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、膀胱癌细胞、上皮癌细胞、胶质瘤细胞、颅咽管瘤细胞、室管膜瘤细胞、松果体瘤细胞、血管母细胞瘤细胞、听神经瘤细胞、少突神经胶质瘤细胞、脑膜瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞、子宫内膜癌细胞、非小细胞肺癌细胞、头颈癌细胞或肾癌细胞。
11、在具体的实施方式中，所述循环肿瘤细胞(ctc)是卵巢卵黄囊瘤细胞。
12、在一些实施方式中，所述富集可以采用本领域已知的方式来进行。例如，可以采用基于细胞密度的离心法、基于细胞体积大小的滤膜过滤法、靶向循环肿瘤细胞的磁珠，或者采用微流控技术来富集所述样本中的循环肿瘤细胞。
13、在一些实施方式中，所述基础培养基可以选自m199培养基、dmem/f12培养基、imdm培养基、dmem培养基、高糖dmem培养基或knockout-dmem培养基。
14、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基包含高糖dmem(h-dmem)培养基。
15、在一些实施方式中，所述第一培养基包含5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19或20％(体积比)的胎牛血清。
16、在一些实施方式中，所述第二培养基和/或所述第二培养基包含knockout-dmem培养基。
17、在一些实施方式中，所述第二培养基可以包含knockouttm血清替代物，例如包含5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19或20％(体积比)的knockouttm血清替代物。
18、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含生长因子。在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基可以包含，例如生长因子包括：表皮生长因子(egf)、神经生长因子(ngf)、脑衍生神经营养因子(bdnf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、干细胞因子(scf)、胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子-β(tgf-β)中的一种或多种。
19、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基可以包含10～50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
20、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基可以包含10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml、30ng/ml、31ng/ml、32ng/ml、33ng/ml、34ng/ml、35ng/ml、36ng/ml、37ng/ml、38ng/ml、39ng/ml、40ng/ml、41ng/ml、42ng/ml、43ng/ml、44ng/ml、45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml或50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
21、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基可以包含10～50ng/ml的表皮生长因子。
22、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基可以包含10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml、30ng/ml、31ng/ml、32ng/ml、33ng/ml、34ng/ml、35ng/ml、36ng/ml、37ng/ml、38ng/ml、39ng/ml、40ng/ml、41ng/ml、42ng/ml、43ng/ml、44ng/ml、45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml或50ng/ml的表皮生长因子。
23、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含抗生素，例如可以包含0％～5％(体积比)的青霉素-链霉素。
24、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基含有0％、1％、2％、3％、4％或5％(体积比)的青霉素-链霉素混合液。
25、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含小分子添加剂，例如丙酮酸钠、内皮素-1、转铁蛋白、胆固醇等。
26、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含0.1mm～10mm的丙酮酸钠。
27、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含0.1mmmm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm或10mm的丙酮酸钠。
28、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含1mm的丙酮酸钠。
29、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含氨基酸。示例性的氨基酸包括：必需氨基酸，如，例如，苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及其他氨基酸，例如，精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。
30、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含0.1mm～10mm的谷氨酰胺。
31、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含0.1mmmm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm或10mm的谷氨酰胺。
32、在一些实施方式中，所述第一培养基和/或所述第二培养基还可以包含1mm的谷氨酰胺。
33、在一些实施方式中，所述血清包括胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清、马血清、猪血清、兔血清、山羊血清或兔血清。
34、在一些实施方式中，所述血清为胎牛血清。
35、在一些实施方式中，所述血清替代物包括knockouttm血清替代物、n2或b27。
36、在一些实施方式中，所述血清替代物为knockouttm血清替代物。
37、在一些实施方式中，所述第一培养基可以包含：h-dmem培养基、5％～20％fbs、10～50ng/mlfgf、10～50ng/ml egf、0.1～10mm丙酮酸钠、0.1～10mm l-谷氨酰胺和0％～5％的青霉素-链霉素混合液。
38、在一些实施方式中，所述第一培养基可以包含：h-dmem培养基、10％fbs、20ng/mlfgf、20ng/ml egf、1mm丙酮酸钠、1mm l-谷氨酰胺和2％的青霉素-链霉素混合液。
39、在一些实施方式中，所述第二培养基可以包含：knockout-dmem培养基、5％～20％knockouttm血清替代物(ksr)、10～50ng/mlfgf、10～50ng/ml egf、0.1～10mm丙酮酸钠和0.1～10mm l-谷氨酰胺。
40、在一些实施方式中，所述第二培养基可以包含：knockout-dmem培养基、10％knockouttm血清替代物(ksr)、20ng/ml fgf、20ng/ml egf、1mm丙酮酸钠和1mm l-谷氨酰胺。
41、在一些实施方式中，所述方法的所述步骤3)中，培养时间为10～36h。
42、在一些实施方式中，所述方法的所述步骤3)中，培养时间为10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h或36h。
43、在一些实施方式中，所述方法的所述步骤3)中，培养时间为24h。
44、在一些实施方式中，所述方法的所述步骤3)中，使用所述第一培养基培养10～36h后，将所述第一培养基替换成所述第二培养基，进行维持培养。
45、在一些实施方式中，本公开使用的培养基是经过过滤除菌的，例如可以使用0.22μm孔径的过滤器过滤除菌。
46、在一些实施方式中，所述方法还可以包括以下步骤：
47、5)所述第二培养产物经胰蛋白酶消化处理之后，使用所述第一培养基重悬并进行培养；
48、6)使用所述第二培养基替换所述第一培养基进行维持培养；
49、7)任选地，重复步骤5)和6)。
50、在一些实施方式中，在步骤5)中，培养10～36h，然后将所述第一培养基替换成所述第二培养基，进行维持培养。
51、在一些实施方式中，在步骤5)中，培养10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h或36h，然后将所述第一培养基替换成所述第二培养基，进行维持培养。
52、在一些实施方式中，所述受试者通常是指生物体。
53、在一些实施方式中，所述受试者可以是动物。示例性的动物包括但不限于：人；实验动物，如小鼠、大鼠、猴子和黑猩猩；家养动物，如狗和猫；农业动物，如牛、马、猪、绵羊、山羊；以及野生动物，如熊、狮子、老虎、豹、大象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚和鲸。
54、根据本公开的另一方面，提供了一种试剂盒，其用于本公开的循环肿瘤细胞的富集和培养方法。
55、在一些实施方式中，所述试剂盒包括本公开上述的第一培养基和第二培养基。
56、根据本公开的另一方面，提供了所述循环肿瘤细胞的富集和培养方法与所述试剂盒在富集和培养循环肿瘤细胞中的应用。
57、在一些实施方式中，所述循环肿瘤细胞(ctc)是转移性ctc。
58、在一些实施方式中，该ctc可以包括，但不限于，急性白血病细胞、急性t细胞白血病细胞、急性淋巴细胞性白血病细胞、急性髓细胞性白血病细胞、成髓细胞性白血病细胞、前髓细胞性白血病细胞、髓单核细胞白血病细胞、单核细胞白血病细胞、红白血病细胞、慢性白血病细胞、慢性髓细胞性(粒细胞)白血病细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、真性红细胞增多症细胞、淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症细胞(macroglobulinemia cell)、重链病细胞、肉瘤细胞、纤维肉瘤细胞、粘液肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、软骨肉瘤细胞、成骨性肉瘤细胞、淋巴管肉瘤细胞、间皮瘤细胞、尤因瘤细胞(ewing'stumor cell)、平滑肌肉瘤细胞、横纹肌肉瘤细胞、结肠癌细胞、结直肠癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、卵巢卵黄囊瘤细胞、前列腺癌细胞、去势抗性前列腺癌细胞(castration resistantprostate cancer cell)、鳞状细胞癌细胞、基底细胞癌细胞、腺癌细胞、汗腺癌细胞、皮脂腺癌细胞、乳头状癌细胞、乳突状腺癌细胞、囊腺癌细胞、髓样癌细胞、支气管原性细胞、肾细胞癌细胞、肝细胞瘤细胞、胆管癌细胞、绒毛膜癌细胞、精原细胞瘤细胞、胚胎性癌细胞、维尔姆斯瘤细胞(wilms'tumor cell)、宫颈癌细胞、子宫癌细胞、睾丸肿瘤细胞、肺癌细胞、小细胞肺癌细胞、膀胱癌细胞、上皮癌细胞、胶质瘤细胞、颅咽管瘤细胞、室管膜瘤细胞、松果体瘤细胞、血管母细胞瘤细胞、听神经瘤细胞、少突神经胶质瘤细胞、脑膜瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞、子宫内膜癌细胞、非小细胞肺癌细胞、头颈癌细胞或肾癌细胞。
59、在具体的实施方式中，所述循环肿瘤细胞(ctc)是卵巢卵黄囊瘤细胞。
60、与现有技术相比，采用本发明的培养方法能快速、简便地分离培养循环肿瘤细胞系，获得数量巨大，且便于保存、扩增的循环肿瘤细胞。该方法为深入研究循环肿瘤细胞的自然发生过程，查找新的循环肿瘤细胞标记和药物提供了有力的工具。
1.一种循环肿瘤细胞的富集和培养方法，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的所述样本来自患有或者曾经患有实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤的受试者；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基础培养基选自m199培养基、dmem/f12培养基、imdm培养基、dmem培养基、高糖dmem培养基或knockout-dmem培养基；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清包括胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清、马血清、猪血清、兔血清、山羊血清或兔血清；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养基包含：h-dmem培养基、5％～20％fbs、10～50ng/ml fgf、10～50ng/ml egf、0.1～10mm丙酮酸钠、0.1～10mm l-谷氨酰胺和0％～5％的青霉素-链霉素混合液；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，培养时间为10～36h；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受试者包括生物体；
9.一种试剂盒，其用于本公开的循环肿瘤细胞的富集和培养方法。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述第一培养基和所述第二培养基。
