本发明关于中药鉴别，尤其涉及一种基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法及其应用。
背景技术：
1、炮制是一种古老的中药加工技术，通过使用炒、蒸、煮、炖等方法，对临床特定需要的中药材进行加工。炮制目的是增效减毒，其机制源于炮制过程引起的化学成分转化。目前已有多种分析技术用于阐释炮制引起的整体性化学转化，以揭示中药增效减毒炮制机理的科学内涵。例如，基于色谱的表征方法，包括lc-ms、gc-ms和sfc，以及非色谱分离策略(直接灌注质谱、敞开式离子化质谱等)已在中药复杂成分分析方面取得了进展。但当前对于炮制介导的化学成分转化研究，往往仅关注少数已知化学成分的变化，这不符合中药整体性的特征，无法准确阐释炮制过程中所发生的转化途径。
2、人参经蒸制制得红参。红参性温，微苦；归脾、肺、心经；具有大补元气，复脉固脱，补血益气的功效。相比于人参，红参补气中带有温燥之性，长于提升阳气，适用于临床回阳救逆治疗。传统对于人参蒸制过程中化学成分转化的研究，多利用hplc或lc-ms法监测有限数量的人参皂苷成分，覆盖度低且无法直观展示差异成分的转化过程。
技术实现思路
1、针对以上技术问题，本发明提供一种基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法及其应用，该方法解吸电喷雾电离质谱成像(desorption electrospray ionization massspectrometry imaging，desi-msi)技术，通过优化的成像条件对待测人参样品进行皂苷类成分和脂质类成分的原位分析，以特定皂苷类成分和脂质类成分为特征标志物，能够区分人参生品及其蒸制品。
2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，利用解吸电喷雾电离质谱成像技术对待测人参样品进行检测，以皂苷类成分和/或脂质类成分为特征标志物，通过所述特征标志物的离子响应强度区分人参生品及其蒸制品；
4、所述皂苷类成分包括人参皂苷rh4及其同分异构体以及下述皂苷类成分中的至少一种：越南参皂苷r12(vinaginsenoside r12)、竹节参皂苷iva丁酯(chikusetsusaponiniva butyl ester)、人参皂苷rh26、越南参皂苷r21(vinaginsenoside r21)(24s/r)或其同分异构体、竹节参皂苷iva，以及6'-o-乙酰基-人参皂苷rg1(6'-o-acetyl-ginsenosiderg1)；
5、所述脂质类成分包括tg(15:1(9z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso3]或其同分异构体、pa(p-16:0/16:1(9z))或其同分异构体、pa(o-16:0/18:4(6z,9z,12z,15z))或其同分异构体、tg(12:0/22:3(10z,13z,16z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、tg(12:0/20:0/22:5(7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、tg(12:0/18:0/22:4(7z,10z,13z,16z))[iso6]或其同分异构体、dg(14:0/22:5(7z,10z,13z,16z,19z)/0:0)[iso2]或其同分异构体、tg(12:0/20:1(11z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、dehydrophytosphingosine或其同分异构体、pc(o-22:2(13z,16z)/22:3(10z,13z,16z))或其同分异构体、pi(13:0/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))或其同分异构体、10,13-十八碳二烯酸(10,13-octadecadienoic acid)或其同分异构体、pa(12:0/22:2(13z,16z))或其同分异构体、帕拉金糖(palatinose)、棕榈酸(palmitic acid)或其同分异构体、pa(14:0/22:4(7z,10z,13z,16z))或其同分异构体、13-酮基-9z-油酸(13-keto-9z-octadecenoic acid)或其同分异构体、硬脂酸(stearic acid)或其同分异构体、9z-十八碳二烯酸(9z-octadecenedioicacid)或其同分异构体、10z-十六烯基乙酸酯(10z-hexadecenyl acetate)或其同分异构体、16-甲基-6z,9z,12z-十七碳三烯酸(16-methyl-6z,9z,12z-heptadecatrienoic acid)或其同分异构体，以及3b,16a-dihydroxyandrostenone sulfate或其同分异构体。
6、其中人参皂苷rh4的同分异构体包括人参皂苷rk3和人参皂苷rh16。
7、本发明基于特定的人参皂苷和脂质的成像条件，通过对人参在不同蒸制时间下人参皂苷和脂质类成分的空间分布进行表征以及hdi数据处理与可视化分析，获得了典型皂苷/脂质类离子在蒸制前后的空间分布情况；进一步基于质谱成像非靶标代谢组学技术，通过多元统计分析方法获得了可作为蒸制前后质谱成像的特征标志物的上述7个人参皂苷类成分和22个脂质类成分。本发明提供的上述特征标志物可用于区分人参生品和蒸制品。
8、结合第一方面，正离子模式下脂质类成分的特征标志物为tg(15:1(9z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso3]
9、或其同分异构体、pa(p-16:0/16:1(9z))或其同分异构体、pa(o-16:0/18:4(6z,9z,12z,15z))或其同分异构体、tg(12:0/22:3(10z,13z,16z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、tg(12:0/20:0/22:5(7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、tg(12:0/18:0/22:4(7z,10z,13z,16z))[iso6]或其同分异构体、dg(14:0/22:5(7z,10z,13z,16z,19z)/0:0)[iso2]或其同分异构体、tg(12:0/20:1(11z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、dehydrophytosphingosine或其同分异构体、pc(o-22:2(13z,16z)/22:3(10z,13z,16z))或其同分异构体，以及pi(13:0/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))或其同分异构体；
10、负离子模式下脂质类成分的特征标志物为10,13-十八碳二烯酸或其同分异构体、pa(12:0/22:2(13z,16z))或其同分异构体、帕拉金糖、棕榈酸或其同分异构体、pa(14:0/22:4(7z,10z,13z,16z))或其同分异构体、13-酮基-9z-油酸或其同分异构体、硬脂酸或其同分异构体、9z-十八碳二烯酸或其同分异构体、10z-十六烯基乙酸酯或其同分异构体、16-甲基-6z,9z,12z-十七碳三烯酸或其同分异构体，以及3b,16a-dihydroxyandrostenonesulfate或其同分异构体。
11、结合第一方面，利用解吸电喷雾电离质谱成像技术对待测人参样品进行检测具体包括以下步骤：
12、s1、将待测人参根部样品包埋后冰冻15～25min，切片，厚度为35～45μm；
13、s2、将s1所得切片固定于载玻片上，用配有解吸电喷雾电离(desi)源的高分辨质谱成像仪获得皂苷类成分和脂质类成分的成像实验数据。
14、结合第一方面，s1中包埋所用的包埋剂为cmc-na(羧甲基纤维素钠)包埋剂。cmc-na包埋剂相对其它包埋剂对仪器的影响小，不会影响样品检测，其他常用包埋剂(如oct)在检测过程中可能被检测到，影响样品信号强度。cmc-na包埋剂浓度优选采用2.5％。
15、结合第一方面，s1中冰冻的温度为-60～-80℃。进一步优选的温度为-80℃，以获得更理想的硬度，便于切片。
16、优选地，所述切片在低温切片机中进行，所述切片机的箱体温度低于样品头温度2～4℃，防止因为箱体温度高而造成组织卷片，不能很好地和载玻片贴合。可选在切片过程中将箱体温度设置为-22℃，将样品头温度设置为-18℃。切片温度太低则切片容易碎裂不成形状，而切片温度太高则切片将出现褶皱变厚。
17、优选地，获得皂苷类成分的成像实验数据时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂为含有0.1mm氯化铵的95％v/v甲醇。
18、优选地，获得皂苷类成分的成像实验数据时，所述解吸电喷雾电离质谱成像的质谱条件包括：负离子模式；毛细管电压：4.5kv，锥孔电压：60v，离子源温度：130℃。在负离子模式下不同亚型的人参皂苷整体上成像效果优于正离子的成像效果。
19、优选地，获得脂质类成分的成像实验数据时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂为含有0.01mm三氟乙酸的甲醇。
20、优选地，获得脂质类成分的成像实验数据时，负离子与正离子模式分别采集；在负离子化模式下：毛细管电压为4.5kv，锥孔电压为60v，离子源温度为120℃；在正离子化模式下：毛细管电压为3.5kv，锥孔电压为60v，离子源温度为110℃。
21、第二方面，本发明还提供了上述方法在研究人参皂苷成分转化规律中的应用。
22、人参皂苷种类和相对含量的变化对其功效有重要影响。本发明提供的上述方法能够对人参根部皂苷进行原位空间表征，从而用于研究人参皂苷成分转化规律。经实验验证，利用本发明提供的上述方法能够明显看到大部分的人参皂苷由于高温蒸制通过脱去丙二酰基、脱糖基、脱乙酰基等方式发生显著降解，尤其分子量较大的人参皂苷。
23、本发明的有益效果在于：本发明基于高分辨质谱成像表征技术以及特定的成像条件，能够实现人参根部皂苷类成分和脂质类成分的原位空间表征；基于本发明所提供的质谱成像方法以及特征标志物和判断标准，可准确区分人参生品和人参蒸制品，为人参蒸制前后的功效变化、临床用药功效区别等研究以及人参及其蒸制品质量控制提供了物质基础层面的理论依据。该方法还可用于研究人参皂苷成分转化规律，进而有利于进一步研究人参皂苷种类及相对含量的变化与功效变化之间的关联。
1.一种基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，以皂苷类成分和/或脂质类成分为特征标志物，通过所述特征标志物的离子响应强度区分人参生品及其蒸制品；
2.根据权利要求1所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，正离子模式下脂质类成分的特征标志物为tg(15:1(9z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso3]或其同分异构体、pa(p-16:0/16:1(9z))或其同分异构体、pa(o-16:0/18:4(6z,9z,12z,15z))或其同分异构体、tg(12:0/22:3(10z,13z,16z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、tg(12:0/20:0/22:5(7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、tg(12:0/18:0/22:4(7z,10z,13z,16z))[iso6]或其同分异构体、dg(14:0/22:5(7z,10z,13z,16z,19z)/0:0)[iso2]或其同分异构体、tg(12:0/20:1(11z)/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))[iso6]或其同分异构体、dehydrophytosphingosine或其同分异构体、pc(o-22:2(13z,16z)/22:3(10z,13z,16z))或其同分异构体，以及pi(13:0/22:6(4z,7z,10z,13z,16z,19z))或其同分异构体；
3.根据权利要求1所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，利用解吸电喷雾电离质谱成像技术对待测人参样品进行检测具体包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，s1中包埋所用的包埋剂为cmc-na包埋剂。
5.根据权利要求4所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，s1中冰冻的温度为-60～-80℃；和/或
6.根据权利要求3所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，获得皂苷类成分的成像实验数据时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂为含有0.1mm氯化铵的95％v/v甲醇。
7.根据权利要求3所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，获得皂苷类成分的成像实验数据时，所述解吸电喷雾电离质谱成像的质谱条件包括：负离子模式；毛细管电压：4.5kv，锥孔电压：60v，离子源温度：130℃。
8.根据权利要求3所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，获得脂质类成分的成像实验数据时，所述解吸电喷雾电离质谱成像中的喷雾溶剂为含有0.01mm三氟乙酸的甲醇。
9.根据权利要求3所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法，其特征在于，获得脂质类成分的成像实验数据时，负离子与正离子模式分别采集；在负离子化模式下：毛细管电压为4.5kv，锥孔电压为60v，离子源温度为120℃；在正离子化模式下：毛细管电压为3.5kv，锥孔电压为60v，离子源温度为110℃。
10.权利要求1～9任一项所述的基于质谱成像区分人参生品与蒸制品的方法在研究人参皂苷成分转化规律中的应用。
