本发明属于生物，具体涉及基于改造dna糖基化酶的碱基编辑器。
背景技术：
1、遗传疾病是临床治疗的难题，目前绝大部分遗传疾病都没有有效的治疗手段。基因编辑是消除这类疾病的有效方法之一，利用基因编辑技术只需一次治疗就可长期改变病人的dna，达到永久治愈的效果。迄今为止，已知的人类致病性突变中，约一半是点突变(也称为单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism，snp)。高效、准确地纠正致病性snp对于研究和治疗遗传性疾病具有重要意义。
2、碱基编辑(base editing，be)无需产生dna双链断裂，也无需供体dna的参与，可实现靶位点的精准点突变，在单核苷酸遗传疾病治疗上具有重大应用前景。现有的碱基编辑器主要有胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，cbe)，可将一定窗口内的胞嘧啶核苷酸转化为胸腺嘧啶核苷酸(c>t)；腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，abe)，可将一定窗口内的腺嘌呤核苷酸转化为鸟嘌呤核苷酸(a>g)以及糖基化酶碱基编辑器(glycosylase base editor，gbe)，在大肠杆菌中可将胞嘧啶核苷酸编辑成腺嘌呤核苷酸、在哺乳动物细胞中可将胞嘧啶核苷酸特异性编辑成鸟嘌呤核苷酸。
3、目前的糖基化酶碱基编辑器gbe需要依赖胞嘧啶脱氨酶，先将胞嘧啶(c)脱氨变为尿嘧啶(u)，然后通过uracil dna glycosylase(udg)将u切除，形成ap位点，最终经过细胞修复或复制系统，完成碱基编辑。该过程用到了胞嘧啶脱氨酶，这可能会引起在细胞rna或dna的cas9非依赖性脱靶突变。而且目前可以实现碱基颠换的只有gbe实现c·g到g·c，，本专利开发了用于胸腺嘌呤的新型碱基编辑器。
技术实现思路
1、本发明所要解决的主要问题是如何提高碱基编辑器的编辑效率，开发适用于胸腺嘧啶和鸟嘌呤的碱基编辑器。
2、为了解决上述问题，本发明提供了一种蛋白质。
3、本发明提供的蛋白质可为如下：
4、a1)所述蛋白质是氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；
5、a2)在a1)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
6、所述蛋白质具体可为胸腺嘧啶dna糖基化酶thymine dna glycosylase(tdg)。所述tdg蛋白的编码序列(cds)可为序列表中序列1所示的cdna分子或dna分子。
7、本发明还提供了上述与蛋白质的相关的生物材料，可为下述b1)-b7)中的至少一种：
8、b1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；
9、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
10、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体或含有b2)所述表达盒的重组载体；
11、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、含有b2)所述表达盒的重组微生物或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
12、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
13、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、含有b2)所述表达盒的转基因植物组织或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；
14、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、含有b2)所述表达盒的转基因植物器官或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。
15、上述生物材料中，b1)所述核酸分子为tdg基因，所述tdg基因的编码序列(cds)为序列表中序列1所示的cdna分子或dna分子。
16、本发明还提供了一种融合蛋白质，所述融合蛋白质含有前文所述的蛋白质。
17、上文中，所述融合蛋白质含有前文所述的蛋白质和ncas9蛋白质。
18、上述融合蛋白质中，所述融合蛋白质的氨基酸序列可为如下c1)或c2)：
19、c1)氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；
20、c2)在c1)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。
21、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
22、所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
23、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质cas9的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质cas9的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质cas9且具有蛋白质cas9功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
24、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
25、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
26、序列3中，第2-8位是sv40 nls的氨基酸序列，第9-228位是胸腺嘧啶dna糖基化酶的氨基酸序列，第229-245位是linker的氨基酸序列，第246-1612位是cas9蛋白的氨基酸序列，第1613-1628位是nucleoplasmin nls的氨基酸序列，第1629-1635是sv40 nls的氨基酸序列。
27、本文中，所述cas9蛋白可为经过密码子优化的蛋白质。
28、在异源表达系统中，优化步骤可以提高宿主产生外源蛋白的能力。蛋白质表达是由一系列包括那些影响转录、mrna加工及翻译的稳定性和起始的因素的许多因素控制的。多核苷酸优化步骤可以包括提高宿主产生外源蛋白能力的步骤，以及辅助研究人员有效地设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括，例如，翻译起始区的修饰、mrna结构元件的改变和不同密码子偏倚性的使用。优化核酸序列以提高在细菌宿主中异源蛋白的表达的方法在本领域中是已知的。
29、例如，可以通过识别由宿主异源表达所需的氨基酸序列开始优化过程。可以从该氨基酸序列设计候选多核苷酸或dna序列。在设计合成dna序列时，密码子选择的频率可以与宿主表达有机体的密码子选择进行比较和稀有宿主密码子可以从合成序列中除去。此外，合成的候选dna序列可以被修饰以除去不想要的限制性酶切位点，以及添加或移除任何所需的信号序列、接头或非翻译区。可以分析合成dna序列中可能会干扰的翻译过程的二级结构的存在，如g/c重复序列和茎-环结构。在候选dna序列合成之前，可以检验优化的序列设计以确认该序列正确编码所需的氨基酸序列。最后，可以使用dna合成技术合成候选dna序列，如本领域中已知的那些合成技术。
30、本发明还提供了与上述融合蛋白质的相关的生物材料，可为下述中至少一种：
31、d1)编码前文所述融合蛋白质的核酸分子；
32、d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；
33、d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体或含有d2)所述表达盒的重组载体；
34、d4)含有d1)所述核酸分子的重组微生物、含有d2)所述表达盒的重组微生物或含有d3)所述重组载体的重组微生物；
35、d5)含有d1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、含有d2)所述表达盒的转基因植物细胞系或含有d3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
36、d6)含有d1)所述核酸分子的转基因植物组织、含有d2)所述表达盒的转基因植物组织或含有d3)所述重组载体的转基因植物组织；
37、d7)含有d1)所述核酸分子的转基因植物器官、含有d2)所述表达盒的转基因植物器官或含有d3)所述重组载体的转基因植物器官。
38、上述生物材料中，编码d1)所述融合蛋白质的核酸分子含有编码tdg蛋白的编码序列和含有编码cas9蛋白的编码序列；所述tdg蛋白质的编码序列(cds)为序列表中序列2的cdna分子或dna分子；所述cas9蛋白质的编码序列(cds)为序列表中序列4的第709-4812为或序列11的cdna分子或dna分子。
39、所述融合蛋白质的编码序列可为序列4，序列4中第1-663位是胸腺嘧啶dna糖基化酶的编码基因的编码序列，第664-714位是linker的核苷酸序列，第715-4815位是cas9的编码基因的编码序列。
40、所述融合蛋白质中的cas9蛋白的编码基因的编码序列也可为将序列4的第715-4815位替换为序列11所示的核苷酸序列。
41、d3)所述重组载体可为重组载体ptbc，ptbc的核苷酸序列可为序列16，序列16中，第3999-4019位是sv40 nls序列，第4020-4679位是胸腺嘧啶dna糖基化酶tdg3的编码基因，第4680-4730位是linker基因，第4731-8831位是cas9蛋白的编码基因，第8832-8879位是nucleoplasmin nls序列。第1-21是sv40 nls序列。tbc含有编码名称为tdg3-ncas9-nls(ncas9表示人源化ncas9)融合蛋白的基因，能够表达氨基酸序列是序列3的融合蛋白质。
42、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
43、本文所述载体是本领域技术人员公知的，能够方便地进行重组dna步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pacyc184。
44、载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整dna(total dna)，或可以使用转座子(transposon)。
45、本发明的载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性等。
46、上述生物材料中，所述微生物可以是细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳细胞。
47、上述生物材料中，所述微生物为原核微生物。
48、上述生物材料中，所述原核微生物为革兰氏阴性细菌、埃希氏菌属细菌或大肠杆菌bl21(de3)或大肠杆菌mg1655或大肠杆菌dh5α。
49、本发明还提供了前文所述的蛋白质tdg在制备碱基编辑器产品中的应用。
50、上述与蛋白质tdg相关的生物材料或所述融合蛋白质或所述的生物材料在用于基因编辑、降低脱靶效应或提高编辑效率中的应用也属于本发明要求保护的范围。
51、人源udg经过点突变，得到thymine dna glycosylase(tdg)具有将胸腺嘧啶从dna链切除形成ap位点的能力。将该tdg与cas9 nickase(ncas9，只切割靶向链)融合构建了tdg-ncas9碱基编辑器，通过grna的引导，tdg-ncas9可以实现dna链中特定位点c和t的切除，形成ap位点。根据修复机制的不同，最终可以实现多种全新的编辑方式(原理示意如图1所示)。
52、本发明提供了一种将改造过的dna糖基化酶与具有特定dna序列靶向能力的酶(如cas9)结合，直接切除目标碱基，形成ap位点的碱基编辑器。后续ap位点经过基因组修复或复制，可以实现碱基编辑。相对于之前的碱基编辑器，这种基于糖基化酶的碱基编辑器，不需要脱氨酶，具有更简单的编辑机制，更小的尺寸，更少的脱靶影响等优势。
1.蛋白质，所述蛋白质为如下a1)或a2)：
2.与权利要求1所述的蛋白质的相关的生物材料，为下述中的至少一种：
3.权利要求2所述的生物材料，其特征在于：b1)所述核酸分子为tdg基因，所述tdg基因的编码序列(cds)为序列表中序列1所示的cdna分子或dna分子。
4.融合蛋白质，所述融合蛋白质含有权利要求1所述的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白质，其特征在于：所述融合蛋白质含有权利要求1所述的蛋白质和ncas9蛋白质。
6.根据权利要求4或5所述的融合蛋白质，其特征在于：所述融合蛋白质的氨基酸序列为如下c1)或c2)：
7.与权利要求4-6中任一所述的融合蛋白质的相关的生物材料，为下述中至少一种：
8.权利要求7所述的生物材料，其特征在于：编码d1)所述融合蛋白质的核酸分子含有编码权利要求1所述的蛋白质的编码序列和含有编码cas9蛋白的编码序列；所述编码权利要求1所述的蛋白质的编码序列为序列表中序列1的cdna分子或dna分子；所述cas9蛋白质的编码序列(cds)为序列表中序列4的第715-4815位，或序列11的cdna分子或dna分子；
9.权利要求1中所述的蛋白质在制备碱基编辑器产品中的应用。
10.权利要求2或3中所述的生物材料，权利要求4-6任一所述的融合蛋白质，权利要求7或8所述的生物材料在用于基因编辑、降低脱靶效应或提高编辑效率中的应用。
