本申请涉及生物医药领域，具体涉及嵌合抗原受体t细胞及其制备方法、重组载体、细胞和应用。
背景技术：
1、嵌合抗原受体t细胞(car-t)技术是一种新型免疫细胞疗法，是通过基因工程改造的t细胞，使其表达肿瘤抗原特异性car，将抗原抗体结合机制和t细胞的杀伤作用相耦合，从而实现肿瘤细胞的特异性杀伤，并且不受人类白细胞抗原(hla)的限制，被认为是目前肿瘤最有效的治疗方式之一。
2、nkg2d配体(nkg2dl)多数在肿瘤细胞上表达，在正常细胞上几乎不表达，为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点。
3、car-t在临床上治疗肿瘤仍然存在一定的风险，比如细胞因子释放综合征(crs)、免疫效应细胞相关神经毒性综合症(icans)等，很可能对患者产生毒副作用。此外，将人体内源的nkg2d蛋白的胞外段作为car的胞外抗原结合域构建car-t细胞时，nkg2d蛋白在t细胞上也表达，影响car阳性率的检测，导致对car-t的质量控制存在较大的风险。因此，开发安全有效、质量可控的car-t具有重要的价值和意义。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本申请提供了嵌合抗原受体t细胞及其制备方法、重组载体、细胞及其应用，其中嵌合抗原受体t细胞能够表达靶向nkg2dl的嵌合抗原受体和egfrt标签蛋白，靶向nkg2dl的嵌合抗原受体可以专一性地靶向表达nkg2dl的肿瘤细胞，激活t细胞发挥细胞免疫作用，对nkg2dl阳性肿瘤细胞实现高效且特异性的杀伤，具有持久的细胞活力和杀伤力；同时根据表达的egfrt标签蛋白可以实现对car阳性率的准确检测，并且该嵌合抗原受体可以被egfr的抗体药物清除，提高安全性。
2、第一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体t细胞，包括靶向nkg2dl的嵌合抗原受体和egfrt标签蛋白，所述egfrt标签蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
3、可选的，所述靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的nkg2d胞外区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述nkg2d胞外区的氨基酸序列包括seq id no：2所示的氨基酸序列。
4、可选的，所述靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括seq id no：3所示的氨基酸序列。
5、可选的，所述egfrt标签蛋白的核苷酸序列如seq id no：4所示。
6、本申请提供的嵌合抗原受体t细胞能够表达靶向nkg2dl的嵌合抗原受体和egfrt标签蛋白，从而可以专一性地靶向表达nkg2dl的肿瘤细胞，实现高效且特异性的杀伤；同时可以对car阳性率进行准确检测，并且该嵌合抗原受体t细胞可以被egfr的抗体药物清除，安全性高。
7、第二方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法，包括：
8、提供靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的编码基因和egfrt标签蛋白的编码基因，将所述靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的编码基因和所述egfrt标签蛋白的编码基因插入到基因传递载体中，得到重组基因传递载体；
9、将所述重组基因传递载体进行包装并转染宿主细胞，得到重组慢病毒；
10、将所述重组慢病毒转染cd3阳性t淋巴细胞，获得嵌合抗原受体t细胞。
11、可选的，所述重组基因传递载体中，所述靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的编码基因和所述egfrt标签蛋白的编码基因之间具有剪切肽的编码基因。
12、可选的，所述重组基因传递载体中，所述egfrt标签蛋白的编码基因的5’端连接第一信号肽的编码基因。
13、进一步的，所述第一信号肽包括gmcsfra信号肽、cd8α信号肽、gm-csf信号肽、cd28信号肽、cd4信号肽、cd5信号肽、cd134信号肽和cd137信号肽中的至少一种。
14、本申请提供的制备方法简单，可以大规模应用，以得到具有优异杀伤性和安全性的嵌合抗原受体t细胞。
15、第三方面，本申请提供了一种重组载体，包括靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的编码基因和egfrt标签蛋白的编码基因。
16、本申请提供的重组载体安全高效，有利于嵌合抗原受体编码基因的保存和复制，并可以用于嵌合抗原受体t细胞的制备。
17、第四方面，本申请提供了一种细胞，包括第三方面所述的重组载体。
18、本申请提供的细胞安全可靠，有利于嵌合抗原受体t细胞的制备。
19、第五方面，本申请提供了第一方面所述的嵌合抗原受体t细胞、第二方面所述的制备方法制得的嵌合抗原受体t细胞、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的细胞在制备预防、诊断和治疗表达nkg2dl的肿瘤的药物中的应用。
20、本申请提供的嵌合抗原受体t细胞、重组载体、细胞可以靶向表达nkg2dl的肿瘤，从而高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，同时安全性高，在表达nkg2dl的肿瘤的预防、诊断和治疗等方面有广泛的应用前景。
1.一种嵌合抗原受体t细胞，其特征在于，包括靶向nkg2dl的嵌合抗原受体和egfrt标签蛋白，所述egfrt标签蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体t细胞，其特征在于，所述靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的nkg2d胞外区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述nkg2d胞外区的氨基酸序列包括seq id no：2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原受体t细胞，其特征在于，所述靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括seq id no：3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体t细胞，其特征在于，所述egfrt标签蛋白的核苷酸序列如seq id no：4所示。
5.一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，包括：
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述重组基因传递载体中，所述靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的编码基因和所述egfrt标签蛋白的编码基因之间具有剪切肽的编码基因。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重组基因传递载体中，所述egfrt标签蛋白的编码基因的5’端连接第一信号肽的编码基因；
8.一种重组载体，其特征在于，包括靶向nkg2dl的嵌合抗原受体的编码基因和egfrt标签蛋白的编码基因。
9.一种细胞，其特征在于，包括权利要求8所述的重组载体。
10.如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体t细胞、如权利要求5-7任一项所述的制备方法制得的嵌合抗原受体t细胞、如权利要求8所述的重组载体或如权利要求9所述的细胞在制备预防、诊断和治疗表达nkg2dl的肿瘤的药物中的应用。
