本发明涉及生物检测，特别涉及short pago蛋白和apaz蛋白的异源二聚体复合物及其向导rna、表达载体和应用。
背景技术：
1、argonaute(ago)蛋白是crispr系统之外的另一种可编程蛋白，其最先发现于真核生物，而后发现该类蛋白在原核生物中也大量存在。ago蛋白可通过短的单链dna或rna向导，来寻找并切割互补的dna或rna靶标分子。根据生物信息学分析，原核ago(prokaryoticargonaute，pago)蛋白可以分为两大类，分别为long pago与short pago，其中long pago又可分为long-a pago与long-b pago。long pago蛋白含有n、paz、mid、及piwi四个结构域，其中piwi是负责切割靶标核酸的结构。short pago与long pago不同，short pago只含有mid与piwi结构域，并且其piwi结构域是失活的，因此short pago不具有核酸切割活性。生信分析发现，short pago常常与一个含有apaz结构域的蛋白相关联，该蛋白与short pago蛋白编码于同一个操纵子内，且该蛋白常常会融合一个效应蛋白结构域，例如sir2、tir或核酸内切酶(nuclease)结构域。
2、现有技术中，专利wo2023014222a1公开了sir2-apaz蛋白以及tir-apaz蛋白会与其相关联的short pago蛋白形成异源二聚体复合物，并且可通过向导rna识别靶标dna，从而激活该复合物的nad+水解酶活性。但其对于nuclease-apaz蛋白相关联的short pago蛋白的功能活性，研究的比较少。发明人发现nuclease-apaz蛋白和与其相关联的short pago蛋白也可以形成异源二聚体复合物，该复合物在向导rna的指导下，与互补的靶标dna结合，激活其非特异性核酸酶活性，从而可以切割荧光报告核酸，释放出荧光信号。
技术实现思路
1、针对以上现有技术的不足，本发明提供了short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物及其向导rna、表达载体，还提供了其在核酸检测中的应用，通过设计特定的向导rna与该short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物配套使用，当向导rna与待检测的靶标dna结合后可激活该复合物的非特异性核酸内切酶活性，进而对荧光报告核酸进行切割，释放出荧光信号，通过荧光检测器检测荧光值，实现对目标核酸的检测。具体通过以下技术实现：
2、第一方面，本发明首先提供了short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物，其包括short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白；所述short pago蛋白含有mid和piwi结构域；所述nuclease-apaz蛋白含有nuclease和apaz结构域；所述short pago蛋白与nuclease-apaz蛋白相互关联。
3、上述的apaz结构域与short pago互作相关，而nuclease结构域则负责具有核酸内切酶活性。
4、上述nuclease-apaz蛋白为duf4365-apaz蛋白、hnh-apaz蛋白、smek-apaz蛋白、rease-apaz蛋白、rease-tir-apaz蛋白中的一种，这五种蛋白之间的区别在于核酸内切酶结构域的不同，duf4365-apaz蛋白的核酸内切酶结构域为duf4365，hnh-apaz蛋白的核酸内切酶结构域为hnh，smek-apaz蛋白的核酸内切酶结构域为smek，rease-apaz蛋白的核酸内切酶结构域为rease，rease-tir-apaz的核酸内切酶结构域为rease-tir，这五种蛋白均能与short pago蛋白形成异源二聚体复合物。
5、优选地，上述nuclease-apaz蛋白为duf4365-apaz蛋白；duf4365-apaz蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6、进一步地，上述short pago蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7、第二方面，本发明提供了一种向导rna，向导rna与short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物结合后，可进一步与靶标dna结合，从而激活所述异源二聚体复合物的非特异性核酸内切酶的活性。向导rna的5’端的核苷酸为尿嘧啶核苷酸。靶标dna的核苷酸序列如seq id no.5所示。
8、上述向导rna只有在5’端的核苷酸为尿嘧啶时，才能激活short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物的非特异性核酸内切酶活性。向导rna的长度为15-40nt。
9、优选地，上述向导rna的长度为18-25nt。
10、更有选地，上述向导rna为gr-1、gr-2、gr-3、gr-4及gr-5，其核苷酸序列分别如seqid no.6-10所示。
11、第三方面，本发明提供了上述short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物的表达载体，其构建方法为：将所述short pago基因和nuclease-apaz基因组装至表达空载中，得到表达载体。纯化标签只位于short pago蛋白或nuclease-apaz蛋白的前面，这是由于short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白能够相互作用，未带标签的蛋白会也能被一起纯化出来。
12、上述short pago基因和nuclease-apaz基因前面均含有控制蛋白表达的启动子及rbs序列。
13、进一步地，上述表达空载为pet28a载体；一般来说，市场上购买或实验室自制的pet28a载体都可以用于构建该表达载体中。
14、进一步地，上述纯化标签位于nuclease-apaz蛋白的前面。
15、上述纯化标签为his标签、mbp标签、gst标签中的一种。一般的，其它类型的纯化标签也可以用于纯化上述short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白。
16、优选地，上述纯化标签为his标签。
17、第四方面，本发明还提供了一种核酸检测反应体系，其包括上述short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物和上述向导rna；还包括缓冲系统、待检测的靶标核酸及荧光报告核酸。
18、上述short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物应用在核酸检测中的原理为：short pago蛋白能与其相关联的nuclease-apaz蛋白形成异源二聚体复合物，其中，short pago蛋白负责靶标核酸的识别，nuclease-apaz蛋白负责识别后的荧光报告核酸的切割，配合特定的向导rna来识别待检测的靶标核酸。当向导rna与靶标核酸结合后可激活short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物的非特异性核酸内切酶活性，进而对荧光报告核酸进行切割，释放出荧光信号，通过荧光检测器检测荧光值，实现对靶标核酸的检测。
19、优选地，上述荧光报告核酸为单链或双链dna，其5’和3’端分别连有荧光基团和淬灭基团；靶标核酸为单链或双链dna、单链或双链rna中的一种。
20、更优选地，上述荧光报告核酸为单链dna，其两端序列反向互补，可退火形成茎环结构；上述靶标核酸为单链dna。
21、进一步地，上述short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物与向导rna的浓度比为1:(1-2)；反应体系的温度控制在30-75℃；反应时间不超过2h。
22、优选地，上述short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物的浓度为50-1000nm。
23、优选地，上述反应体系的温度为37℃。
24、优选地，上述缓冲系统为pbs缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液等可以维持ph稳定的缓冲体系中的一种，ph需要维持在7.5-8.0。
25、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
26、1、本发明首次发现了原核short argonaute蛋白(short pago)以及编码于同一操纵子中相关联的nuclease-apaz蛋白会形成异源二聚体复合物，该复合物可以与向导rna结合，并在其引导下识别并结合靶标核酸，从而激活其非特异性核酸内切酶活性，释放出可供检测的信号，从而很好的应用于核酸检测领域中。
27、2、本发明提供的核酸检测反应体系的灵敏度与基于crispr技术的核酸检测方法相当，并且可与其它核酸恒温扩增方法联用，以增强核酸检测的灵敏度以及特异性。
1.short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物，其特征在于，包括short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白；所述pago蛋白含有mid和piwi结构域；所述nuclease-apaz蛋白含有nuclease和apaz结构域；所述pago蛋白与nuclease-apaz蛋白相互关联。
2.根据权利要求1所述的short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物，其特征在于，所述nuclease-apaz蛋白为duf4365-apaz蛋白、hnh-apaz蛋白、smek-apaz蛋白、rease-apaz蛋白、rease-tir-apaz蛋白中的一种。
3.根据权利要求1所述的short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物，其特征在于，所述nuclease-apaz蛋白为duf4365-apaz蛋白。
4.根据权利要求3所述的short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物，其特征在于，所述short pago蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述duf4365-apaz蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
5.一种向导rna，其特征在于，所述向导rna与权利要求1-4任一项所述的short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物结合后，可进一步与靶标dna结合，从而激活所述异源二聚体复合物的非特异性核酸内切酶活性；所述向导rna的5’端的核苷酸为尿嘧啶核苷酸；所述靶标dna的序列如seq id no.5所示。
6.根据权利要求5所述的向导rna，其特征在于，所述向导rna的长度为15-40nt。
7.权利要求1-4任一项所述的short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物的表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法为：将所述short pago基因和nuclease-apaz基因组装至表达空载中，得到表达载体；纯化标签只位于short pago蛋白或nuclease-apaz蛋白的前面。
8.一种核酸检测反应体系，其特征在于，包括权利要求1所述的short pago蛋白和nuclease-apaz蛋白的异源二聚体复合物、权利要求5所述的向导rna、待检测的靶标dna、荧光报告核酸。
9.根据权利要求8所述的核酸检测反应体系，其特征在于，所述荧光报告核酸为单链dna或者双链dna，其5’和3’端分别连有荧光基团和荧光淬灭基团。
10.根据权利要求9所述的核酸检测反应体系，其特征在于，所述荧光报告核酸为两端具有反向互补序列形成茎环结构的单链dna。
